Il danno ischemico induce un ambiente pro-infiammatorio ostile che influisce sulla sopravvivenza delle cellule trapiantate. Il nostro protocollo presenta un metodo alternativo per fornire prodotti biologici aggirando la risposta immunitaria iniziale alle lesioni. Il vantaggio principale di questo protocollo è che consente di somministrare terapie una settimana dopo la lesione, imitando il trattamento nell'ambiente clinico.
Il nostro obiettivo principale è il modello di lesione da riperfusione dell'ischemia e il trapianto di cellule STAMINALI. Tuttavia, questo approccio può anche essere utilizzato per modelli di malattie infiammatorie che comportano l'introduzione di terapie biologiche. Inizia con l'autoclave di tutti gli strumenti chirurgici.
Se devono essere eseguiti più interventi chirurgici in una sessione, pulire gli strumenti dopo ogni animale e sterilizzarli di nuovo utilizzando uno sterilizzatore di perline calde. Somministrare per via sottocutanea l'analgesico, pesare l'animale e inserire il peso nel ventilatore. Radere il lato sinistro del torace dallo sterno al livello della spalla e applicare la crema depilatoria per rimuovere la pelliccia in eccesso.
Per prevenire il collasso polmonare, mantenere la pressione espiratoria finale positiva a due centimetri d'acqua per la procedura di riperfusione dell'ischemia e cambiarla in tre centimetri d'acqua per l'iniezione ritardata della procedura delle cellule. Dopo aver anestetizzato il mouse, intubarlo con un tubo endotracheale calibro 20 e trasferirlo su una pastiglia di riscaldamento controllata per mantenere una temperatura corporea da 35 a 37 gradi Celsius. Posizionare il mouse in recumbency laterale con estremità cranale a sinistra e estremità caudale a destra.
Strofinare l'area chirurgica alternando iodio povidone e tamponi di alcol tre volte e applicare unguento oftalmico su entrambi gli occhi. Utilizzare un bisturi della lama numero 10 per fare un'incisione verticale di 2,5 millimetri a destra del capezzolo più a sinistra nel campo visivo, quindi utilizzare le forbici per tagliare gli strati muscolari superficiali fino a quando il muscolo intercostale e le costole sono visibili. Durante il sollevamento delle costole e del tessuto circostante, tagliare lo spazio intercostale tra la quarta e la quinta costola, quindi inserire il retrattile della palpebra nello spazio aperto.
Ritrarre il pericardio usando forcep curve, spostando il polmone verso l'alto e fuori dalla vista. Passare una sutura di nylon 9-0 attraverso il miocardio sotto l'arteria LAD 2,5 millimetri distale al padiglione auricolare sinistro mantenendo un movimento liscio e coerente per prevenire la lacerazione del tessuto o forare un vaso sanguigno principale. Legare un nodo quadrato sciolto, quindi posizionare un centimetro di tubi di polietilene all'interno del nodo sciolto.
Fissare la sutura intorno al tubo e confermare l'ischemia da pallore e aritmia ventricolare, quindi rilasciare dopo 35 minuti. Dopo aver rimosso il tubo, attendere cinque minuti per confermare la ri-perfusione del miocardio. Posizionare un tubo catetere IV calibro 24 nella cavità toracica uno spazio intercostale a destra dell'apertura.
Utilizzare 6-0 suture assorbibili per chiudere l'incisione intercostale in un semplice modello interrotto e lo strato muscolare in un modello di sutura continua. Dopo aver chiuso lo strato muscolare superficiale, rimuovere il tubo toracico mentre si ritira l'aria dalla cavità toracica con una siringa tubercocina millilitro. Chiudere l'incisione cutanea con una sutura assorbibile 6-0 in un modello di materasso orizzontale continuo.
Al termine, somministrare 1,5 millilitri di soluzione salina calda per via sottocutanea e applicare un unguento antibiotico triplo al sito di incisione per prevenire l'infezione. Trasferire il mouse in una gabbia libera da letto o in una gabbia con biancheria da letto coperta su un pad caldo e una temperatura da 35 a 37 gradi Celsius fino a quando non viene completamente recuperato. Dopo aver preparato e intubato il mouse come descritto in precedenza, rimuovere la sutura dallo strato cutaneo con forbici e forcep, quindi utilizzare un bisturi numero 10 per fare un'incisione nella stessa posizione dell'intervento chirurgico precedente.
Continuare a tagliare il tessuto cicatriziale fino a quando la sutura dello strato muscolare è visibile, quindi utilizzare le forbici e le forcelle per rimuovere la sutura e tagliare lo strato muscolare aperto. Rimuovere le suture tenendo insieme le costole e continuare a tagliare attraverso il muscolo intercostale dalla precedente incisione. Posizionare il riavvolgitore della palpebra nello spazio intercostale e individuare l'area della legatura precedente.
Caricare 300.000 cellule STAMINALI mesenchimali sospese in 20 microlitri di PBS in una siringa per insulina calibro 30 e piegare leggermente l'ago per ottenere l'angolo corretto per l'iniezione. Muovendosi nella direzione dall'apice verso la base del cuore, inserire la siringa nella regione peri-infarto fino a quando l'apertura dell'ago è completamente all'interno del miocardio, quindi iniettare lentamente le cellule nel miocardio, attendere tre secondi e rimuovere l'ago. Osservare attentamente il cuore per tre minuti per assicurarsi che non vi sia alcuna reazione anomala alle cellule come la fibrillazione ventricolare.
Dopo tre minuti, posizionare un tubo catetere IV calibro 24 nella cavità toracica uno spazio intercostale a destra dell'apertura. Chiudere gli strati intercostali del muscolo e della pelle e rimuovere il tubo toracico come descritto in precedenza. Somministrare 1,5 millilitri di soluzione salina calda per via sottocutanea e applicare un unguento antibiotico triplo al sito di incisione per prevenire l'infezione.
Trasferire il mouse in una gabbia o in una gabbia senza lettiera con biancheria da letto coperta su un pad caldo fino a quando non viene completamente recuperato. L'ecocardiogramma post-operatorio e l'elettrocardiogramma sono stati eseguiti il giorno successivo all'impianto di cellule STAMINALI, confermando l'infarto e la diminuzione della funzione contrattile ventricolare. Un ulteriore esame dei dati ha mostrato che la frazione di espulsione e l'accorciamento frazionato sono diminuiti nei topi che hanno ricevuto lesioni ischemiche, mentre i volumi diastolici e sistolici finali sono aumentati.
La colorazione tricromatica di Masson del tessuto miocardico sette giorni dopo la lesione ha mostrato un aumento della deposizione di collagene e il diradamento della parete ventricolare sinistra nei cuori dei topi che hanno ricevuto lesioni ischemiche. L'imaging bioluminescente in vivo o BLI è stato eseguito il giorno dopo l'impianto di cellule STAMINALI mesenchimali. Il successo della consegna degli MSC è esemplificato dal segnale BLI rispetto ai topi che avevano indotto lesioni da riperfusione dell'ischemia ma non hanno ricevuto MSC.
Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che piccoli movimenti intenzionali quando si tagliano gli intercostali, legando il vaso e iniettando cellule sono vitali per prevenire danni indebiti al cuore o al polmone nel campo visivo. Queste procedure offrono la possibilità di monitorare la funzione cardiaca dopo il trapianto attraverso ultrasuoni, vitalità cellulare tramite imaging a bioluminescenza o ulteriori tecniche molecolari o biochimiche a seconda della terapia utilizzata.
