未発達で組織化されていないサルコメアによる多能性幹細胞由来心筋細胞におけるサルコメア機能の評価は困難である。蛍光タグ付きサルコメアタンパク質を使用して、サルコメアの短縮にアクセスできるようになりました。サルコメアを可視化し、幹細胞由来の心筋細胞と蛍光タグ付きサルコメアタンパク質を使用してインビトロで機能を評価することができます。
AAVベースの伝達を用いて、患者由来の人工多能性幹細胞にこの方法を拡大することができます。この方法は、体外症療法の開発に拡大することができ、それは直接にインビトロで疾患関連サルコメア機能不全を評価するために使用することができる。この方法は、小児心臓病学研究を含む心臓病学分野で有用である。
しかし、筋症などの骨格筋機能障害の研究にも応用できる。分化誘導の日から4つを引いた日に、PBSで希釈したラミニン-511 E8の平方センチメートルあたり0.5マイクログラムの6ウェルプレートをコーティングし、摂氏37度と5%の二酸化炭素で30分のインキュベーションを行います。インキュベーションの終わりに近づいて、人間が誘発する多能性幹細胞を摂氏37度で3分間組み換えトリプシンで治療する。
細胞が剥離したら、細胞を10%FBSで補って計数し、遠心分離後にラミニン-511 E8とROCK阻害剤を添加したAK02N培地の2ミリリットル当たり1.25倍から5番目の細胞に細胞を再懸濁する。次に、6ウェルプレートの各ウェルからコーティング溶液を吸引し、各ウェルに2ミリリットルの細胞を播種する。プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。
4日後、細胞は80%の合流に達する。分化を誘導するためにGSK-3阻害剤を添加したインスリン培地なしで、各ウェルの上清を2ミリリットルのRPMIプラスB27に置き換えます。分化の2日後、 穏やかに 1 ウェルあたりヤマアラシ阻害剤を補充するインスリン培地なしで RPMI プラス B27 の 2 ミリリットルで培地を交換します。.
細胞は100%の合流に達しているはずです。分化の4日目に、上清を2ミリリットルのRPMIとB27に優しく交換します。細胞は高密度のままで、一部は浮き始めている可能性があります。
分化の7日目と9日目に、各ウェルの上清を、選択的多能性幹細胞由来心筋細胞培養のためにプロマイシンを補充したインスリンで、RPMIとB27の2ミリリットルに置き換えます。この時点で、細胞を叩く細胞は培養内で観察されるべきである。パターン化された多能性幹細胞由来の心筋細胞培養を行う場合は、まず、修理テープを使用して、カスタムメイドのPDMSスタンプの表面からほこりを取り除き、スタンプを70%エタノールに簡単に沈めます。
エアーダスターを使用して、スタンプ表面からエタノールを取り除き、0.5%MPCポリマーとエタノールの5〜10マイクロリットルで表面を処理します。ポリマーが完全に乾燥したら、35ミリメートルのイメージング皿の中のポリマーカバースリップにスタンプを置き、スタンプに重みを置きます。10分後、軽い顕微鏡を使用してパターンがカバースリップに移されたことを確認し、PBSで皿とカバースリップを2回洗います。
2回目の洗浄後、カバースリップにラミニン-511 E8の1平方センチメートルあたり0.5〜1マイクログラムをコーティングし、0.1%ゼラチンで希釈し、室温で2〜4時間のインキュベーションを行います。分化の10日目に、PBSで細胞を2回洗浄し、続いて摂氏37度で3〜5分間、1回の組換えトリプシンを1回ずつ処理する。カウント後、RPMIとB27のミリリットル当たり5番目の細胞に2.5〜5倍の細胞をピューロマイシン濃度で補充し、1ミリリットルの細胞をプレートに播種して摂氏37度で一晩培養します。
翌朝、上清を新鮮なRPMIプラスB27にピューロマイシンを添加したインスリンで置き換え、細胞を培養インキュベーターに戻し、イメージングのために週21〜28日まで培地を2〜3回リフレッシュする。PCCSM培養におけるサルコメア短縮のタイムラプスイメージングのために、蛍光共焦点顕微鏡の100倍の対物レンズに油を塗布し、関連ソフトウェアでライブイメージング条件を選択します。良好な代表データを得るためには、最も高いフレームレートを選択し、シャッターを開くように設定し、取得領域の作物に4対4のビニングを適用して、タイムラプスイメージング中の画像間の最短間隔を達成します。
細胞の拍動率が低い場合は、電界刺激によって細胞を呼び起こし、タイムラプス記録を開始し、画像化中に画像フィールドが焦点を当てたままであることを注意してください。イメージング期間の終了時に、タイムラプス画像を適切なフォルダに保存します。タイムラプス画像を解析するには、一連のタイムラプス画像をImageJに開き、サルコメアパターンが明確に観察されるまで画像の明るさとコントラストを調整します。
[その他のツール] メニューで SarcOptiM を選択し、コントロール Shift P キーとツールバーの 1 ミクロン ボタンを押して、プログラムの調整手順を使用します。次に、サルコメアの領域を横切ってサルコメアの短縮を測定し、単一セルAVIをクリックしてサルコメア短縮解析を開始します。サルコメア標識されたパターン多能性幹細胞由来心筋細胞のタイムラプスイメージングは、異なる時点でのサルコメア短縮を測定するために使用することができる。
パターン化された多能性幹細胞由来心筋細胞培養で典型的に認められるサルコメアの解体を克服するために、特定のPDMSスタンプは、ストライプパターンでパターン化された多能性幹細胞由来心筋細胞を培養するために使用することができ、これは、非パターン領域で培養された細胞と比較して、細長い細胞形状およびより組織化されたサルコメアパターンを促進する。パターン化培養はまた、より良い細胞収縮を促進し、非パターン培養細胞と比較して滑らかなサルコメア長さのプロファイルを提供する。AAVトランスデューセドパターン多能性幹細胞由来の心筋細胞は、パターン化された多能性幹細胞由来心筋細胞に沿って肉体GFPシグナルを早くも3日後に発現させ、サルコメア収縮プロファイルの測定にも使用できる。
また、トランスダクション時にブラストシジン耐性遺伝子を添加することで、90%以上の純度にパターン化された多能性幹細胞由来の心筋細胞選択を容易にして、より容易かつ高品質な画像解析を容易にするために、直線的に移動するサルコメアを有する領域を同定し、最高フレームレートで画像を得ることが不可欠である。この方法を用いて、肉腫タンパク質における成熟の役割を評価し、疾患特異的な患者由来のiPS細胞に由来するラボ心筋細胞におけるサルコメア機能障害を研究することができる。
