提示されたプロトコルは、経口バイオフィルムを制御するために、天然物の生理活性候補を正しくスクリーニングし、分析するために使用されます。また、他のバイオフィルム研究分野での応用にも適応できます。この最も澱粉のスクリーニングおよび分析方法は、同時に生理活性成分を除去することを可能にする。
虫歯は、バイオフィルムダイエット由来、非常に流行、慢性疾患である。このプロトコルは、バイオフィルムを制御し、その結果、虫歯を制御するために天然物を識別するのに役立ちます。まず、抽出溶媒を水性アルコール混合物で調製する。
抽出溶媒のミリリットル当たり50〜100ミリグラムの濃度をサンプリングし、マイクロチューブで15分間の超音波補助抽出を行います。抽出を3回繰り返します。各抽出工程の後、遠心分離して試料を遠心し、固体残渣を脱キャップし、上清を除去する。
各抽出ステップから上清を組み合わせて、それらをフィルタリングします。化学分析とバイオアッセイのためのアリコートを保存します。分画については、粗抽出試料を希釈し、初期抽出溶媒を用いて1ミリリットル溶液あたり100ミリグラムを得る。
次に、このサンプルの1ミリリットルを、吸収剤の1グラムと6ミリリットルの容量を備えた予条件固相抽出カートリッジに移します。各抽出LUNの約3つのデッドボリュームを使用して分画を行い、LUN構成によって1分数を収集します。化学分析とバイオアッセイのためのアリコートを保存します。
真空、窒素流、または凍結乾燥の下で溶媒を除去し、重量と収率を登録します。可能な限り最良の溶媒で乾燥物質を再構成します。テキスト原稿の式を使用して、ストック溶液の溶媒濃度を計算します。
血寒天上のS.mutans UA 159の微生物株を再活性化し、液体培養培地で培養する。同じ培養培地を用いて初期培養液の1~20希釈を行い、中対成長期に達するまでインキュベートする。抗菌アッセイ用のTYEGと、バイオフィルムアッセイ用の1%スクロースを使用してTYEEで定義された集団を使用して接種を準備します。
抗菌活性については、分析用のサンプル濃度を定義し、それを96ウェルプレートに加えます。テキスト原稿に記載されているように、各版に一連のコントロールを含めます。TYEGを使用して、体積を100マイクロリットルに調整し、100マイクロリットルの微生物培養液を接種し、5%の二酸化炭素で摂氏37度で24時間プレートをインキュベートします。
井戸の目視検査により濁度に応じて細菌の増殖を分析します。特定の寒天プレート中の目的の希釈液のアリコートを重複して接種し、プレートをインキュベートする。インキュベーション後、コロニーカウントを行う。
マイクロチューブでヒドロキシアパタイトビーズの重量を量り、それらを殺菌します。次にビーズを洗浄し、吸着バッファーAb.を使用して500マイクロリットルの唾液をマイクロチューブに加えて唾液膜を形成し、40分間毎分24回転で摂氏37度でインキュベートする。唾液上清を取り除き、ビーズをAbで3回洗い、下流アッセイに備えます。
唾液ペリクルのビーズを含む各マイクロチューブにサンプルまたはコントロールの500マイクロリットルを加え、毎分24回転、摂氏37度で30分間インキュベートします。各マイクロチューブに500マイクロリットルの微生物培養液を加え、同様の条件で1時間チューブをインキュベートして、ビーズを3回洗浄します。次いで、非結合細胞をAbバッファーで3回洗浄します。
各サンプルを1ミリリットルのAbバッファで再中断し、センカデを7ワットで30秒間再中断します。各懸濁液のアリコートを10倍に連続して希釈し、特定の寒天プレートにプレートします。5%の二酸化炭素で摂氏37度で48時間プレートをインキュベートし、コロニーを数えます。
データ解析のために、バイオアッセイの生データをスプレッドシートに入力し、各処理による微生物増殖阻害のログを計算し、微生物増殖阻害の対数割合を制御と比較した。測定値の光学密度を補正し、バイオマス阻害率を計算します。C.シルヴェストリス抽出物、すなわちシルヴェストリス、中間体、およびリングアの3種類のクレロダン型ジテルペンおよびグリコシル化フラボノイドの量に対する生物学的スクリーニングの化学的プロファイルをここに示す。
生データの分析後、4つの抽出物が好ましい反応を示した。これら4つの抽出物のクロマトグラフィーデータは、クレロダン型ジテルペンとグリコシル化フラボノイドの同時存在を示す。さらに、それらは同じバイオームおよび多様性を含む。
処理されたプランクトニック細胞のCFUパーセント、処理されたバイオフィルムのバイオマスのパーセント、および処理されたバイオフィルムのパーセントCFUをここに示す。唾液ペリクルに付着したS.mutans細胞の除去に有意に影響を与える粗抽出物はなかった。グルカンマトリックスへのS.mutans細胞の接着は、3つの粗抽出物によって弱まった。
各植物種は最適化された特定の化学分析方法を必要とするため、最良の溶媒分数および分析方法は、以前のレポートから選択するか、実験計画によって定義する必要があります。最も活性な粗抽出物と分数を用いて製剤を調製し、複雑なモデルでテストしてバイオフィルムやキャビティの開発を防ぐことが重要です。
