Nous tenons à remercier Lindsey W. Plasschaert et Justin Sui pour leurs contributions substantielles à l’élaboration précoce de ce protocole. Les auteurs sont reconnaissants à la communauté des mouches pour leur générosité avec les réactifs, et en particulier à Ruth Lehmann et Benjamin Lin pour leur don de la ligne nos5'-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' avant sa publication. Les stocks obtenus du Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537) ont été utilisés dans cette étude. Ce travail a été soutenu par NIH RO1 GM060804, R33AG04791503 et R35GM136270 (S.D) ainsi que par des bourses de formation T32GM007229 (B.W.) et F32GM125123 (L.A.).

1. Préparation du jour avant la dissection
<ol><li>Affûter électrolytiquement une aiguille en tungstène24 de sorte que le diamètre résultant soit d’environ 0,03 mm. Réglez la tension fournie à environ 14 V et utilisez 3,3 M NaOH. L’affûtage ne devrait pas prendre plus de 1 ou 2 min. ATTENTION: Le NaOH est très corrosif et causera des brûlures au contact de la peau. Portez des gants et des lunettes lors de la manipulation et travaillez à l’intérieur d’une hotte aspirante. REMARQUE: Après utilisation, stocker NaOH dans un tube Falcon en polypropylène.</li>
	<li>Fabriquez le support d’imagerie préparé. Dans un tube conique de 15 mL, combiner 4,25 mL de milieu de Schneider avec 750 μL de sérum fœtal bovin (FBS, concentration finale de 15 %) et 27,5 μL de pénicilline-streptomycine (0,05 U/μL de pénicilline, concentration finale de 0,05 μg/μL). Conservez ce support d’imagerie préparé à 4 °C.</li>
	<li>Faire une solution de colle heptane. Ajouter environ 0,5 mL d’heptane à un flacon scellable de 20 mL bourré de ruban adhésif double face d’environ 20 cm. Balancer sur un nutateur pendant environ une heure, ou remuer avec une pointe de pipette jusqu’à ce qu’une consistance entre celle de l’eau et du glycérol soit atteinte. Cette solution de colle dissoute durera plusieurs jours avant que l’heptane ne s’évapore. Pour rafraîchir la solution, ajoutez 0,5 mL d’heptane supplémentaire et de la roche. REMARQUE: Une solution efficace de colle heptane peut être préparée en utilisant différents rapports d’heptane à ruban adhésif, ainsi que des durées variables de bascule / agitation. Les spécifications ci-dessus ne sont que des suggestions pour préparer ou rafraîchir une telle solution adéquate.</li>
</ol>2. Collecte d’embryons – 15–17 h avant la dissection
<ol><li>Ajouter la pâte de levure fraîche à une assiette de gélose au jus de pomme25. Installez une cage de collecte d’embryons en ajoutant des mouches adultes (âgées de moins de 10 jours) à une bouteille de nourriture vide, perforée de petits trous26. Boucher la cage de collecte à l’aide de la plaque de gélose à levure, scotchée à la bouteille, et placer la cage avec la plaque côté vers le bas dans un incubateur sombre à 25 ° C pendant 1 h. REMARQUE: Les mouches doivent exprimer un transgène qui marquera la gonade par fluorescence, par exemple, six4-eGFP::Moesin20, car la dissection des embryons aura lieu sous un microscope stéréo-fluorescent. Voir tableau des matériaux pour une liste des génotypes utilisés pour marquer la gonade.</li>
	<li>Retirez la cage de l’incubateur et jetez cette première collection. Remplacez-le par une plaque de gélose fraîchement levurenée et replacez la cage dans l’incubateur pendant 2 h. REMARQUE: La première collection d’embryons est utilisée pour débarrasser les femelles des embryons fécondés et en développement, afin d’obtenir une deuxième collecte d’embryons étroitement chronométrée.</li>
	<li>Retirez la plaque de gélose de la cage et placez-la (avec le côté levure tourné vers le haut) sur une serviette en papier humide à l’intérieur d’un récipient en plastique scellable. Placez cette chambre humide dans un incubateur à 25 °C pour vieillir les embryons pendant 14,5 h (âges finaux, 14,5 à 16,5 h après la ponte). REMARQUE : Immédiatement avant de commencer l’étape 2.4, terminez les étapes 3.1 et 3.2.</li>
	<li>Retirez la plaque de gélose de l’incubateur et, à l’aide d’une bouteille de gicleurs, ajoutez suffisamment d’eau à la plaque de gélose pour dissoudre la pâte de levure en brossant légèrement avec un pinceau. Rincez les embryons et la levure dissoute dans un petit panier en maille assis à l’intérieur d’un bateau de pesée. Rincez le panier avec la bouteille d’eau jusqu’à ce que la plupart de la pâte de levure ait filtré à travers la maille.</li>
	<li>Retirez l’eau du bateau de pesée et replacez le panier à l’intérieur. Déchorionate les embryons en les immergeant dans une solution d’eau de Javel à 50%, à l’aide d’un flacon de gicleurs. La solution d’eau de Javel doit avoir une profondeur de 3 à 5 mm. Gardez les embryons immergés dans de l’eau de Javel pendant environ 2 minutes, avec des tourbillons occasionnels. ATTENTION : L’eau de Javel est corrosive et peut irriter ou endommager les yeux et les voies respiratoires. Portez des gants et des lunettes lorsque vous manipulez de l’eau de Javel. REMARQUE: Pendant ce temps, complétez autant que possible l’étape 3.3. La progression de la décchorionation peut être vérifiée en plaçant le panier sous un stéréomicroscope et en vérifiant l’absence des appendices dorsaux. Immergez les embryons dans la solution d’eau de Javel pendant plus de temps, si nécessaire.</li>
	<li>Jetez l’eau de Javel et rincez soigneusement les embryons à l’intérieur du panier avec de l’eau d’un flacon à gicler (pendant environ 3 s, en épongeant le panier en filet avec des serviettes en papier; répétez 2 à 3 fois).</li>
</ol>3. Préparation du jour de la dissection
<ol><li>Ajouter 30 μL d’insuline (10 mg/mL) à 1 500 μL de milieux d’imagerie préparés (voir étape 1.2) dans un tube d’Eppendorf de 1,5 mL (concentration finale de 0,2 mg/mL). Bien mélanger et laisser le tube sur la paillasse pour l’équilibrer à la température ambiante.</li>
	<li>Préparez des bandes de couverture recouvertes de colle.<ol>
<li>Utilisez un couteau à pointe de diamant pour couper un couvercle de 22 mm x 22 mm en quatre bandes de taille égale (Figure 1A).</li>
		<li>Utilisez des pinces pour ramasser une bande et étaler un total d’environ 30 μL de solution de colle heptane sur les deux côtés de la bande (figure 1B). Pour obtenir une couche uniforme de résidus de colle, inclinez la bande à différents angles pendant que l’heptane s’évapore.</li>
		<li>Rangez la bande recouverte de colle dans une fente vide d’une boîte à couvercles; pour maintenir son adhérence, placez la bande en position inclinée, mais verticale, en vous appuyant contre les bords de la boîte pour minimiser le contact avec les surfaces de la boîte (Figure 1C). Fermez la boîte de manière à ce que les particules à l’air ne recouvrent pas la colle et diminuent son adhérence.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placez les éléments suivants sur la paillasse : une pipette Pasteur en verre de 6 pouces, une lame de microscope, un pipetteur P200 et P1000 avec les embouts de pipette appropriés, la solution27 de Ringer (pH ajusté à 7,3 avec NaOH) et un plat d’imagerie de 35 mm recouvert de poly-D-lysine.</li>
	<li>Transférez les embryons du panier d’écran en maille vers un petit verre de montre rempli d’heptane de 500 à 750 μL.<ol>
<li>Épongez les côtés et le fond du panier à sec avec une lingette en papier. Humidifiez un pinceau dans l’heptane, touchez le pinceau aux embryons (la membrane hydrophobe de vitelline doit adhérer aux poils) et replongez le pinceau dans l’heptane dans le verre de la montre (les embryons doivent couler au fond). REMARQUE: Les étapes suivantes doivent être effectuées le plus rapidement possible pour éviter que les embryons ne se dessèchent. Les embryons ne doivent pas être exposés à l’air pendant plus de 20 s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transférer les embryons sur la lame du microscope à l’aide d’une pipette Pasteur (Figure 1D). Aspirez lentement les embryons dans la pipette et limitez-les à la partie étroite de la pipette. Pipettez lentement les embryons sur la glissière, de sorte qu’ils s’agrègent juste à l’intérieur de l’extrémité de la pipette avant de s’écouler sur la glissière. Tournez le coin d’une lingette de tissu en une pointe fine et évacuez l’heptane des embryons sur la lame. Ils s’agrègeront et couvriront une plus petite surface, ce qui facilitera leur capture sur une bande recouverte de colle à l’étape suivante.</li>
	<li>À l’aide d’une pince, ramassez une bande recouverte de colle et touchez-la doucement aux embryons (Figure 1E). Placez la bandelette dans la boîte d’imagerie, côté embryon vers le haut et juste à l’extérieur du centre revêtu de poly-D-lysine. Appuyez sur la bande sur le plat à l’aide d’une pince pour vous assurer qu’elle est fixée en place. Inonder immédiatement le plat avec 2–3,5 mL de solution de Ringer; immerger d’abord les embryons pour les empêcher de se dessécher (Figure 1F).</li>
</ol>4. Dissection
REMARQUE: Ces étapes doivent être effectuées sous un microscope stéréo-fluorescent.
<ol><li>Dévitiniser 10 à 15 embryons. REMARQUE: Cela peut aller de deux embryons, pour les débutants, à quinze embryons, pour les experts.<ol>
<li>Sélectionnez les embryons de stade 16 en fonction de la morphologie intestinale (Figure 2). À ce stade, les embryons ont trois constrictions intestinales qui créent quatre segments intestinaux empilés (Figure 2B,B'). Pour commencer la dévittellinisation, percez l’embryon sélectionné à une extrémité, de préférence antérieure, avec l’aiguille de tungstène. L’embryon peut sortir de sa membrane vitelline, mais sinon, décoller la membrane de l’embryon. REMARQUE : Les embryons trop jeunes pour être disséqués ont des intestins non régionalisés (Figure 2C). La dissection d’embryons de stade 17 est possible, mais plus difficile que la dissection d’embryons de stade 16 car la cuticule commence à se développer à ce stade. Les embryons de stade précoce 17 présentent quatre segments intestinaux qui sont décalés les uns par rapport aux autres (Figure 2D,D').</li>
		<li>Accrochez l’aiguille à travers l’embryon dans une région éloignée des gonades. Transférez l’embryon crochu dans la région enrobée de polylysine du plat (à partir de là, appelée simplement « glissement de couverture ») et faites-le glisser contre le fond jusqu’à ce qu’il adhère. Répétez ces étapes et disposez les embryons dévitiinisés en rangée le long du haut du couvercle recouvert de polylysine (Figure 3A), en laissant beaucoup d’espace en dessous pour une dissection plus poussée. REMARQUE: Les gonades apparaissent comme de petits agrégats sphériques de cellules qui devraient fluorescence brillamment, en fonction du marqueur spécifique utilisé et du nombre de copies transgéniques. À ce stade, les gonades sont situées latéralement dans le segment A5, à environ 70% à 80% de la longueur de l’embryon de l’avant. Tout au long du protocole de dissection, le tissu peut coller à l’aiguille. Pour débarrasser l’aiguille des débris, soulevez-la juste au-dessus de la surface de la solution de Ringer. La dévitinisation peut être désordonnée tant que la gonade proprement dite est perturbée le moins possible.</li>
	</ol></li>
	<li>Affiner les gonades hors de l’embryon et sur le plat (Figure 3C,D).<ol>
<li>Tout d’abord, filez l’embryon pour exposer son intérieur (Figure 3C). Trancher l’embryon à partir de son centre, en déplaçant l’aiguille postérieurement, entre les gonades. Taquinez un peu de tissu interne, car cela collera au plat beaucoup mieux que la cuticule externe. L’adhérence du tissu permettra aux manipulations suivantes de révéler la gonade et de lui permettre d’adhérer au glissement de couverture. REMARQUE: Si le tissu ne colle pas au plat, essayez de l’amadouer dans une région non contaminée du couvercle enduit; les parties extérieures du couvercle seront particulièrement collantes. Comme indiqué à l’étape 4.1.2, peu importe si les manipulations de dissection entraînent une carcasse d’embryon mutilée, tant que les gonades restent indemnes.</li>
		<li>Utilisez l’aiguille pour trancher autour d’une gonade jusqu’à ce qu’un morceau de tissu, y compris la gonade, soit séparé de la carcasse restante. Avec l’aiguille, aspirez ce tissu dans une région fraîche de couvercle enduit et amadouez-le contre le fond jusqu’à ce qu’il adhère au plat. REMARQUE: La meilleure imagerie sera obtenue pour les cas où la gonade elle-même se fixe directement au glissement de couverture, plutôt que la fixation indirecte via un tissu sus-jacent. Par conséquent, lorsque le tissu est guidé loin de la carcasse, essayez de faire glisser la gonade avec la couverture en premier, plutôt que des tissus étrangers.</li>
		<li>Retirez autant de tissus environnants de la gonade que possible (figure 3D) en faisant glisser doucement le tissu adhérent loin de la gonade avec l’aiguille. Évitez de toucher directement la gonade, ce qui l’endommagerait (Figure 4E). Pour vous assurer que la gonade adhère suffisamment au plat, déplacez l’aiguille dans un mouvement circulaire doux autour de la gonade – si elle bouge, touchez l’aiguille sur le tissu adhérent restant et dirigez la gonade vers une région fraîche de glissement de couverture collante. Répétez ce processus jusqu’à ce qu’il n’y ait pas de mouvement détectable de la gonade.</li>
		<li>Retournez à la carcasse de l’embryon et disséquez la deuxième gonade. Répétez ce processus sur autant d’embryons que possible, mais ne dépassez PAS 25 min. La viabilité des tissus sera compromise dans la solution de Ringer après plus de ~ 40-45 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Une fois les dissections terminées, utilisez un marqueur indélébile pour ajouter des marques d’enregistrement sur le bord extérieur de la antenne parabolique afin d’enregistrer son orientation pendant la dissection.</li>
	<li>Retirez la bande enduite de colle du plat.<ol>
<li>Insérez doucement la pince inférieure d’une paire de pinces sous la bande, fermoir et inclinez lentement la bande vers le haut pour la libérer du plat avec le moins de glissement possible de la solution de Ringer pour minimiser la perturbation des gonades adhérentes. REMARQUE: La bande doit être inclinée loin des gonades disséquées.</li>
	</ol></li>
	<li>Portez doucement la parabole au microscope d’imagerie de manière à éviter le glissement de la solution de Ringer.</li>
</ol>5. Imagerie
<ol><li>Placez la parabole d’imagerie dans le porte-scène, en utilisant les marques d’enregistrement pour placer la parabole dans l’orientation approximative comme lors de la dissection. À l’aide de la microscopie à fond clair et d’un objectif de faible puissance (~ 10x), identifiez et mettez au point tout morceau de tissu qui adhère au bordereau de couverture. Changez les réglages de l’oculaire pour révéler la fluorescence et, à l’aide des oculaires binoculaires, scannez systématiquement la parabole, en marquant la position de chaque gonade dans le logiciel d’imagerie (voir Tableau des matériaux). REMARQUE: Assurez-vous que les gonades sont centrées dans le champ de vision avant de marquer les positions.</li>
	<li>Retirez délicatement l’ensemble du porte-scène, avec la parabole d’imagerie dans son support, et placez l’ensemble sur l’établi.</li>
	<li>Remplacez la solution de Ringer par le milieu d’imagerie préparé contenant de l’insuline (voir les étapes 1.2 et 3.1).<ol>
<li>Utilisez un P1000 pour retirer toute la solution de Ringer du rebord supérieur intérieur de la parabole d’imagerie (ne pipettez pas Ringer’s de la zone de glissement du couvercle central). Ensuite, passez à un P200 et placez sa pointe juste sous la surface des sonneurs restants dans la région centrale. Retirer délicatement 50–100 μL de Ringer' s; ne supprimez PAS toute la solution.</li>
		<li>Dessinez environ 200 μL de supports d’imagerie et, en plaçant à nouveau la pointe P200 juste sous la surface des sonneurs restants, ajoutez lentement ce support d’imagerie. Ensuite, ajoutez le support d’imagerie restant (~1 300 μL) à la parabole, en commençant par le bord le plus externe du rebord supérieur. Pendant le pipetage, dirigez-vous vers le dôme central du fluide et fusionnez éventuellement les deux en brossant la pointe de la pipette sur les deux. Placez le couvercle sur le plat. REMARQUE : Le support d’imagerie doit couvrir tout le diamètre intérieur de la parabole, avec une profondeur d’environ 2 mm, pour éviter l’évaporation (Figure 4D).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Passez le microscope à un objectif de puissance plus élevée (63x, 1,2 NA), appliquez le fluide d’immersion approprié en fonction de l’objectif utilisé (type de fluide d’immersion et indice de réfraction requis par l’objectif), puis remplacez l’ensemble du porte-scène. Utilisez la microscopie à fond clair pour vous concentrer sur les tissus collés au fond de la boîte d’imagerie. REMARQUE: Si la scène n’a pas été déplacée, la dernière gonade devrait apparaître une fois que l’objectif est concentré.</li>
	<li>Parcourez chaque position de gonade marquée et ajustez cette position, si nécessaire. Sélectionnez les gonades à imager en fonction de la clarté de l’image, du sexe des gonades, etc. Personnalisez les paramètres d’imagerie (multicanal, temps d’exposition, intensités laser, incréments de la série Z, time-lapse avec des intervalles appropriés, etc.). Commencez l’imagerie. REMARQUE: Les gonades mâles peuvent être identifiées par la présence à la fois d’une niche et, à l’extrémité opposée de la gonade, d’un groupe de petites cellules somatiques très circulaires appelées précurseurs gonadiques somatiques spécifiques aux mâles (msSPG). Si le marqueur fluorescent six4-eGFP::moesin est utilisé, les cellules de niche sont les deuxièmes cellules les plus brillantes de la gonade, la plus brillante étant les msSPG. À ce stade, les gonades femelles n’ont ni niche ni msSPG.</li>
</ol>

<ol>
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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+gonad+formation+reveals+roles+for+Six4+in+regulating+germline+and+somatic+cell+migration.">Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration.</a> BMC Devlopmental Biology. 7, 1-9 (2007).</li><li>Sheng, X. R., Brawley, C. M., Matunis, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiating+spermatogonia+outcompete+somatic+stem+cells+for+niche+occupancy+in+the+Drosophila+testis.">Dedifferentiating spermatogonia outcompete somatic stem cells for niche occupancy in the Drosophila testis.</a> Cell Stem Cell. 5, 191-203 (2009).</li><li>Tanentzapf, G., Devenport, D., Godt, D., Brown, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Europe+PMC+Funders+Group+integrin-dependent+anchoring+of+a+stem+cell+niche.">Europe PMC Funders Group integrin-dependent anchoring of a stem cell niche.</a> Nature Cell Biology. 9, 1413-1418 (2007).</li><li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+making+very+fine,+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically+a+motorized+molluscicide+dispenser.">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically a motorized molluscicide dispenser.</a> Bulletin of the World Health Organization. , 105-106 (1960).</li><li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures.">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).</li><li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+and+Larva+Harvesting+and+Preparation.">Embryo and Larva Harvesting and Preparation.</a> JoVE Science Education Database. , (2020).</li><li>Cold Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ringer's+solution+for+Drosophila.">Ringer's solution for Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2011).</li><li>Schuh, M., Lehner, C. F., Heidmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+Drosophila+CID/CENP-A+and+CENP-C+into+Centromeres+during+Early+Embryonic+Anaphase.">Incorporation of Drosophila CID/CENP-A and CENP-C into Centromeres during Early Embryonic Anaphase.</a> Current Biology. 17, 237-243 (2007).</li><li>Lin, B., Luo, J., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collectively+stabilizing+and+orienting+posterior+migratory+forces+disperses+cell+clusters+in+vivo.">Collectively stabilizing and orienting posterior migratory forces disperses cell clusters in vivo.</a> Nature Communications. 11, 1-16 (2020).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).</li><li>Gabay, L., Lowell, S., Rubin, L. L., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+dorsoventral+patterning+by+FGF+confers+trilineage+differentiation+capacity+on+CNS+stem+cells+in+vitro.">Deregulation of dorsoventral patterning by FGF confers trilineage differentiation capacity on CNS stem cells in vitro.</a> Neuron. 40, 485-499 (2003).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Au cours de la gonadogenèse, la gonade embryonnaire, et en particulier la niche de cellules souches dans la gonademâle 15, subit des changements morphologiques rapides. Les mécanismes de développement qui sous-tendent ces changements dynamiques sont mieux compris par des techniques d’imagerie en direct. Cependant, au stade embryonnaire 17, l’imagerie in vivo de la gonade est rendue impossible par l’apparition de contractions musculaires à grande échelle17</su...

Le testicule drosophila melanogaster a servi de paradigme pour notre compréhension de nombreux processus cellulaires dynamiques. Les études de ce modèle ont mis en lumière la régulationde la division des cellules souches 1,2,3, le développement des cellules germinales 4,5, la biologie des arnos 6,7,8 et les événements de signalisation des cellules souches de niche 9,10,11,12,13. Ce modèle est avantageux car il est génétiquement traitable14,15 et est l’un des rares où l’on peut imager en direct des cellules souches dans leur environnement naturel 3,16,17,18. Cependant, l’imagerie en direct de ce modèle a été limitée aux tissus adultes et aux premiers stades embryonnaires, laissant une lacune dans notre connaissance de la dynamique gonadique chez l’embryon tardif, le stade précis où la niche se forme et commence à fonctionner.
La gonade embryonnaire à un stade avancé est une sphère, composée de cellules de niche somatiques à l’antérieure et de cellules germinales enkystées par des cellules gonadiques somatiques dans des régions plus postérieures19. Cet organe peut être imagé en direct in vivo jusqu’au stade embryonnaire précoce 17 17,20,21. Une imagerie supplémentaire est empêchée en raison de l’initiation de contractions musculaires à grande échelle. Ces contractions sont si graves qu’elles poussent la gonade hors du cadre d’imagerie, et un tel mouvement ne peut pas être corrigé avec un logiciel d’imagerie. Notre laboratoire s’intéresse au dévoilement des mécanismes de formation de niches, qui se produit pendant cette période insaisissable pour l’imagerie en direct. Par conséquent, nous avons généré une approche ex vivo pour imager en direct la gonade à partir du stade embryonnaire 16, facilitant l’étude de la dynamique cellulaire pendant cette période cruciale du développement des gonades. Des travaux antérieurs de notre laboratoire montrent que cette imagerie ex vivo récapitule fidèlement le développement in vivo des gonades17. Cette technique est la première et la seule du genre pour la gonade embryonnaire de la drosophile.
Nous présentons ici le protocole de dissection requis pour l’imagerie en direct ex vivo de la gonade à la fin du stade embryonnaire. Ce protocole peut être combiné avec des traitements pharmacologiques ou une manipulation transgénique de lignées cellulaires spécifiques dans les gonades. En utilisant cette technique, nous avons photographié avec succès les étapes de la formation de niche de cellules souches17. Cette approche d’imagerie est donc déterminante pour le domaine de la biologie des cellules souches, car elle permettra de visualiser les premières étapes de la formation de niches en temps réel dans son environnement naturel15,17. Bien que cette méthode soit bénéfique pour le domaine de la biologie des cellules souches, elle est également applicable pour visualiser tous les processus dynamiques se produisant dans les gonades au cours de ce point temporel de développement, y compris les réarrangements cellulaires22, l’adhésion cellulaire 2,12,23 et la migration cellulaire23. Ce protocole de dissection améliorera ainsi notre compréhension de nombreux processus biologiques cellulaires fondamentaux.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alfa Aesar&#160;Tungsten wire</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AA10408G6</td>
			<td>0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. melanogaster: His2Av::mRFP1</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td>
			<td>FBtp0056035</td>
			<td>Schuh, Lehner, &#38; Heidmann, Current Biology, 2007</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato</td>
			<td>Gift from Ruth Lehmann Lab</td>
			<td></td>
			<td>Lin, Luo, &#38; Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5&#39;- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin</td>
			<td></td>
			<td>FBtp0083398</td>
			<td>Sano et al., PLoS One, 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond-tipped knife</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35GC-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, bovine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>l0516</td>
			<td>Store aliquots at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nytex basket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer&#39;s solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe&#8217;s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Insect Media</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and live-imaging of the late embryonic drosophila gonad

La gonade embryonnaire mâle Drosophila melanogaster est un modèle avantageux pour étudier divers aspects de la biologie du développement, y compris, mais sans s’y limiter, le développement des cellules germinales, la biologie des piARN et la formation de niches. Ici, nous présentons une technique de dissection pour imager en direct la gonade ex vivo pendant une période où l’imagerie en direct in vivo est très inefficace. Ce protocole décrit comment transférer des embryons dans une boîte d’imagerie, choisir des embryons mâles mis en scène de manière appropriée et disséquer la gonade de ses tissus environnants tout en maintenant son intégrité structurelle. Après dissection, les gonades peuvent être imagées à l’aide d’un microscope confocal pour visualiser les processus cellulaires dynamiques. La procédure de dissection nécessite un timing et une dextérité précis, mais nous fournissons un aperçu de la façon de prévenir les erreurs courantes et de surmonter ces défis. À notre connaissance, il s’agit du premier protocole de dissection pour la gonade embryonnaire de la drosophile et permettra l’imagerie en direct pendant une fenêtre de temps autrement inaccessible. Cette technique peut être combinée avec des manipulations transgéniques pharmacologiques ou spécifiques au type cellulaire pour étudier tout processus dynamique se produisant à l’intérieur ou entre les cellules dans leur environnement gonadique naturel.

Nous illustrons la préparation de la boîte d’imagerie à la figure 1, comme décrit dans « Préparation du jour de la dissection ». Ces méthodes devraient finalement aboutir à des embryons bien hydratés collés à une bande de couverture, qui est temporairement fixée au fond du plat et immergée dans la solution de Ringer (Figure 1F). Un couteau à pointe de diamant permet de trancher proprement un couvercle de 22 x 22 mm glissé en trois à quatre ban...

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Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Ici, nous fournissons un protocole de dissection nécessaire pour représenter en direct la gonade mâle embryonnaire tardive de la drosophile . Ce protocole permettra d’observer des processus cellulaires dynamiques dans des conditions normales ou après manipulation transgénique ou pharmacologique.

Dissection et imagerie en direct de la drosophile embryonnaire tardive Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

dissection-and-live-imaging-of-the-late-embryonic-drosophila-gonad

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

3.1K vues.  University of Pennsylvania. Ici, nous fournissons un protocole de dissection nécessaire pour représenter en direct la gonade mâle embryonnaire tardive de la drosophile . Ce protocole permettra d’observer des processus cellulaires dynamiques dans des conditions normales ou après manipulation transgénique ou pharmacologique.

Vidéo: Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the cardiac transcriptome from being masked by the global embryonic transcriptome, it is necessary to collect sufficient numbers of hearts for further analyses. Furthermore, as zebrafish cardiac development proceeds rapidly, heart collection and RNA extraction methods need to be quick in order to ensure homogeneity of the samples. Here, we present a rapid manual dissection protocol for collecting functional/beating hearts from zebrafish embryos. This is an essential prerequisite for subsequent cardiac-specific RNA extraction to determine cardiac-specific gene expression levels by transcriptome analyses, such as quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). The method is based on differential adhesive properties of the zebrafish embryonic heart compared with other tissues; this allows for the rapid physical separation of cardiac from extracardiac tissue by a combination of fluidic shear force disruption, stepwise filtration and manual collection of transgenic fluorescently labeled hearts.

To analyse cardiac gene expression profiles during zebrafish heart development, total RNA has to be extracted from isolated hearts. Here, we present a protocol for collecting functional/beating hearts by rapid manual dissection from zebrafish embryos to obtain cardiac-specific mRNA.

À grande échelle de poisson zèbre embryonnaire Coeur Dissection d&#39;analyse transcriptionnelle

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Recherche

Biologie du développement

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-imagerie de la<em&gt; Drosophila</em&gt; Nymphe yeux

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

Dissection et culture du rein embryonnaire de la souris

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

À long terme d&#39;imagerie en direct de<em&gt; drosophile</em&gt; Disc Eye

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

Bioingénierie des microenvironnements humanisés de la moelle osseuse dans la souris et leur visualisation par imagerie en direct

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imagerie en direct de la souris Fusion de palais secondaire

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissection et immunofluorescence souillant de champignon corps et photorécepteur de neurones dans le cerveau adulte Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

Dissection et la coloration des Drosophila ovaires Pupal

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

Dissection de la rétine de pupes de drosophile pour immunohistochimie, analyse occidentale et isolement d’ARN

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Imagerie et analyse en direct des contractions musculaires dans l'embryon de Drosophila

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Dissection et imagerie en direct de la drosophile embryonnaire tardive Gonad

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Live-imagerie de la