免疫蛍光を使用して、ゼブラフィッシュ胚の心臓におけるPM_2.5誘導DNA損傷を検出する

この方法は、ゼブラフィッシュ心臓における標的タンパク質の発現を正確かつ容易に検出するために使用することができる。標的タンパク質の変化は、免疫蛍光を測定することによって直接検出される。テキスト原稿に記載されているようにゼブラフィッシュ胚の収集と治療を行う。

受精後72時間で、胚をガラススライドに移し、ステレオ顕微鏡で観察します。心膜浮腫、ループの変化、サイズの減少などの心臓奇形を記録する。奇形率を計算し、一方の方法ANOVAを使用してグループ間の差異を分析し、続いてトルコの多重比較検定を行います。

ミリリットルMS222あたり0.6ミリグラムで胚を麻酔した後、30秒間心拍を記録し、Image Jソフトウェアを使用して心拍数を定量化します。ステレオ顕微鏡の下で使い捨ての注射針でシマウマの魚の胚から心臓を慎重に解剖する。疎水性バリアペンを使用して、きれいなガラススライドに円を描きます。

4%パラホルムアルデヒドの50マイクロリットルをPBSの1.25マイクロリットルに加えて固定液溶液を作り、解剖した心臓を1つの疎水性バリアサークルに入れ、室温で20分間インキュベートします。溶液を顕微鏡下でデカントし、サンプルを室温で少なくとも5分間乾燥させます。PBSTで3回、洗浄ごとに5分間洗浄します。

50マイクロリットルのBSAを1,000マイクロリットルのPBSTに加えて5%BSA溶液を得て、湿度の高いチャンバーで1時間インキュベートして非特異的抗体結合を遮断します。溶液をデカントし、PBSで3回、洗浄ごとに5分間洗浄します。8-ヒドロキシデオキシグアノシンに対してマウスモノクローナル抗体の2マイクロリットルを希釈し、296マイクロリットルのPBSTでγ-H2AXに対してウサギのポリクローナル抗体を2マイクロリットル希釈し、一次抗体カクテル溶液の働きを得る。

加湿チャンバーに50マイクロリットルの一次抗体カクテル溶液を用いて、心臓サンプルを室温で少なくとも1時間、摂氏4度で一晩インキュベートします。溶液をデカントし、PBSTで3回、洗浄ごとに5分間洗浄します。FITC標識ヤギ抗マウス二次抗体の1マイクロリットルと500マイクロリットルのPBSTのpsy-3ヤギ抗ウサギ二次抗体の1マイクロリットルを希釈し、働く二次抗体カクテル溶液を得る。

暗い温度で1時間二次抗体でサンプルをインキュベートします。溶液をデカントし、PBSで3回、洗浄ごとに5分間洗浄します。核染色用のサンプルに20マイクロリットルのDAPIを加え、室温で30分間インキュベートします。

スライドにカバースリップを適用し、乾燥や動きを防ぐためにマニキュアでそれを密封します。蛍光顕微鏡でサンプルを画像化し、ImageJソフトウェアを使用して心臓領域の蛍光シグナルを定量化します。DMSO制御サンプルの平均を用いて相対変化を計算し、データの統計的有意性を決定します。

抗酸化物質の存在または存在下でPM2.5にさらされた胚は、N-アセチル-L-システイン、またはNAC、心臓奇形の存在について評価した。PM 2.5からのEOMは、DMSO対照処置心臓と比較して、心膜浮腫、変化したループおよびサイズの減少などの心臓奇形発生の有意な増加を犠牲にした。また、EOMに曝露された胚においても心拍数が有意に低下した。

NACの付加はEOM誘発の心臓欠陥を弱めた。EOM処理組織におけるDNA損傷の程度を評価するために免疫蛍光アッセイを用いた。EOMで処理したゼブラフィッシュ胚の心臓では8-ヒドロキシデオキシグアノシンおよびγ-H2AX発現のレベルが有意に増加し、酸化DNA損傷およびDNA二重鎖の破壊の増加を示した。

EOMによるDNA損傷は、NAC補充によって部分的に打ち消された。このプロトコルを試みるとき、ゼブラフィッシュの心臓がスライドから剥がれる可能性があるため、PBSでサンプルを洗浄する際には注意してください。