マウスの内リンパ嚢の解剖

内リンパ嚢は、内耳の正常な発達に必要です。構造的、生理学的、分子的研究のためにin situでアクセスできないため、動物モデル、特にマウスモデルからの解剖が不可欠です。内リンパ嚢の解剖と調製は、その薄くて繊細な上皮構造と、隣接する組織への近接性と接着性のために非常に困難です。

私たちのアプローチは、嚢の視覚化と同定、および隣接する組織からのその分離を容易にします。内リンパ嚢の正常な機能に影響を与える疾患や障害は、聴力とバランスの喪失につながる可能性があります。私たちの技術は、内リンパ嚢機能の根底にある細胞、分子、生理過程を解明するために不可欠です。

その手順を実演するのは、私の研究室のポスドク客員研究員であるHyun Jae Leeです。まず、PBSを含む35mmの組織培養皿に、第8脳神経の根元を上にして内耳の準備を整えます。No.4鉗子を使用して、蝸牛で組織を保持し、前庭水道、前後の半規管、総腱管、およびS状結腸洞を特定します。

次に、1ミリリットルの注射器に取り付けられた27ゲージの針を使用して、硬膜と前庭水道、および内リンパ嚢を囲む下にある結合組織を切開します。内リンパ嚢の外側の結合組織を切開した後、鉗子を使用して結合組織を保持し、側頭骨から引き離して剥がします。残っている破片を慎重に取り除き、内リンパ嚢上皮を周囲の組織から分離します。.

開いた内リンパ嚢の解剖のために、調製物のステム部分を保持して、内腔の断面を観察します。次に、27ゲージの針を内腔に挿入し、それを動かして内リンパ嚢を2枚に切ります。各シート状組織の端を鉗子で保持し、それらを互いに分離します。

代表的な解析では、これらのマウスの頭蓋骨の半分を半分脳を切除する前とした後の頭蓋骨の中央矢状切片をtdTomato蛍光で可視化しました。内リンパ嚢は解剖しなくても容易に見えた。胚16.6日目のマウスの内耳、および出生後5日目と30日目のマウスの内耳を単離しました。

内リンパ嚢は、より高い倍率で観察されました。P30マウスの場合、内リンパ管は骨にカプセル化されているため、分離が困難です。E16.5およびP5由来の無傷の内リンパ嚢の免疫組織化学を、抗SLC26A4抗体およびファロイジン標識を用いて研究しました。

ファロイジンは、内リンパ嚢とその周囲の結膜組織を強調するために使用されました。P5で開いた内リンパ嚢上皮の高倍率画像は、緑色で標識されたSLC26A4が細胞のサブセットの頂端領域に局在していることを示しています。この手順を試みるときに覚えておくべき最も重要なことは、内リンパ嚢を損傷しないように非常に穏やかであることです。

このアプローチによって単離された固定内リンパ嚢組織は、in situハイブリダイゼーション、RNAスコープ、および免疫組織化学に使用できます。生組織は、トランスクリプトーム解析や生理学のためのRNAの調製に使用できます。このアプローチは、内リンパ嚢のトランスクリプトームを全体として、またはシングルセルRNA-seq解析で研究するために使用され、そのさまざまな細胞タイプの特性評価に貢献しています。