생쥐의 내림프낭 해부

내림프낭은 내이의 정상적인 발달에 필요합니다. 구조적, 생리학적, 분자 연구를 위해 현장에서 접근할 수 없기 때문에 동물 모델, 특히 마우스 모델에서 해부하는 것이 필수적입니다. 내림프낭의 절개 및 준비는 얇고 섬세한 상피 구조와 인접 조직과의 근접성 및 부착성으로 인해 매우 어렵습니다.

당사의 접근 방식은 주머니의 시각화 및 식별과 인접 조직과의 분리를 용이하게 합니다. 내림프낭의 정상적인 기능에 영향을 미치는 질병 및 장애는 청력과 균형 상실로 이어질 수 있습니다. 우리의 기술은 내림프낭 기능의 기저에 있는 세포, 분자 및 생리학적 과정을 밝히는 데 필수적입니다.

시술을 시연하는 사람은 제 연구실의 박사 후 연구원인 이현재 씨입니다. PBS가 함유된 35mm 조직 배양 접시에 내이 제제를 배열하고 8번째 뇌 신경의 뿌리를 위로 향하게 하는 것으로 시작합니다. No.4 겸자를 사용하여 달팽이관에서 조직을 잡고 전정관, 전방 및 후방 반고리관, 일반 크러스 및 S상 부비동을 식별합니다.

그런 다음 1밀리리터 주사기에 장착된 27 게이지 바늘을 사용하여 경막과 전정관, 그리고 내림프낭을 둘러싼 기본 결합 조직을 절개합니다. 내림프낭 측면의 결합 조직을 절개한 후 겸자를 사용하여 결합 조직을 잡고 측두골에서 당겨 벗겨냅니다. 남아 있는 이물질을 조심스럽게 제거하고 내림프낭 상피를 주변 조직에서 분리합니다.

열린 내림프낭을 절개하려면 제제의 줄기 부분을 잡고 내강의 단면을 관찰합니다. 그런 다음 27 게이지 바늘을 내강에 삽입하고 움직여 내림프낭을 두 장으로 자릅니다. 각 시트와 같은 조직의 가장자리를 집게로 잡고 서로 분리합니다.

대표 분석에서는 뇌를 절반 제거하기 전과 후의 이들 쥐의 두개골의 중간 시상 부분을 tdTomato 형광으로 시각화했습니다. 내림프낭은 절개 없이도 쉽게 볼 수 있었다. 배아 16.6일째와 출생 후 5일째 및 30일째에 마우스의 내이를 분리했습니다.

내림프낭은 더 높은 배율에서 관찰되었습니다. P30 마우스의 경우, 내림프관은 뼈에 캡슐화되어 있기 때문에 분리하기가 어렵습니다. E16.5 및 P5의 온전한 내림프낭의 면역조직화학은 항SLC26A4 항체 및 팔로이딘 라벨링으로 연구되었습니다.

Phalloidin은 내림프낭과 그 주변의 결막 조직을 강조하는 데 사용되었습니다. P5에서 열린 내림프낭 상피의 고배율 이미지는 녹색으로 표시된 SLC26A4이 세포 하위 집합의 정점 영역에 국한되어 있음을 보여줍니다. 이 시술을 시도할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 내림프낭이 손상되지 않도록 매우 부드럽게 하는 것입니다.

이 접근법으로 분리된 고정된 내림프낭 조직은 in situ hybridization, RNA scope 및 immunohistochemistry에 사용할 수 있습니다. 살아있는 조직은 전사체 분석 및 생리학을 위해 RNA를 준비하는 데 사용할 수 있습니다. 이 접근법은 내림프낭의 전사체를 전체 또는 단일 세포 RNA-seq 분석에서 연구하는 데 사용되어 다양한 세포 유형을 특성화하는 데 기여했습니다.