Le sac endolymphatique est nécessaire au développement normal de l’oreille interne. Puisqu’il est inaccessible in situ pour les études structurales, physiologiques et moléculaires, sa dissection à partir de modèles animaux, en particulier de modèles murins, est essentielle. La dissection et la préparation du sac endolymphatique sont extrêmement difficiles en raison de sa structure épithéliale mince et délicate, ainsi que de sa proximité et de son adhérence aux tissus adjacents.
Notre approche facilite la visualisation et l’identification d’un sac et sa séparation des tissus adjacents. Les maladies et les troubles affectant le fonctionnement normal du sac endolymphatique peuvent entraîner une perte d’audition et d’équilibre. Notre technique est essentielle pour élucider les processus cellulaires, moléculaires et physiologiques sous-jacents aux fonctions du sac endolymphatique.
Hyun Jae Lee, un chercheur postdoctoral invité de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Commencez par organiser la préparation de l’oreille interne dans une boîte de culture tissulaire de 35 millimètres contenant du PBS avec la racine du huitième nerf crânien orientée vers le haut. À l’aide d’une pince n°4, tenez le tissu au niveau de la cochlée et identifiez l’aqueduc vestibulaire, les canaux semi-circulaires antérieur et postérieur, les crus communs et le sinus sigmoïde.
Ensuite, utilisez une aiguille de calibre 27 montée sur une seringue d’un millilitre pour inciser la dure-mère et l’aqueduc vestibulaire, ainsi que les tissus conjonctifs sous-jacents entourant le sac endolymphatique. Après avoir pratiqué une incision dans le tissu conjonctif latéralement au sac endolymphatique, utilisez une pince pour tenir le tissu conjonctif et le peler en le tirant loin de l’os temporal. Retirez soigneusement tous les débris restants et séparez l’épithélium du sac endolymphatique des tissus environnants.
Pour la dissection du sac endolymphatique ouvert, tenez la partie tige de la préparation pour observer la section transversale de la lumière. Insérez ensuite une aiguille de calibre 27 dans la lumière et déplacez-la pour couper le sac endolymphatique en deux feuilles. Tenez le bord de chaque tissu en forme de feuille avec une pince et séparez-les les uns des autres.
Dans l’analyse représentative, une coupe mi-sagittale du crâne de ces souris avant et après l’ablation de la moitié du cerveau a été visualisée avec la fluorescence tdTomato. Le sac endolymphatique était facilement visible même sans dissection. Des oreilles internes de souris au jour embryonnaire 16,6 ainsi qu’aux jours 5 et 30 postnatals ont été isolées.
Les sacs endolymphatiques ont été observés sous un grossissement plus élevé. Pour les souris P30, le canal endolymphatique est difficile à isoler en raison de son encapsulation dans l’os. L’immunohistochimie des sacs endolymphatiques intacts de E16.5 et P5 a été étudiée avec un marquage d’anticorps anti-SLC26A4 et de phalloïdine.
La phalloïdine a été utilisée pour mettre en évidence le sac endolymphatique et le tissu conjonctif qui l’entoure. Les images à fort grossissement de l’épithélium ouvert du sac endolymphatique en P5 montrent que le SLC26A4 marqué en vert est localisé dans la région apicale d’un sous-ensemble de cellules. La chose la plus importante à retenir lors de cette procédure est d’être très doux pour éviter d’endommager le sac endolymphatique.
Un tissu de sac endolymphatique fixe isolé par cette approche peut être utilisé pour l’hybridation in situ, la portée de l’ARN et l’immunohistochimie. Les tissus vivants peuvent être utilisés pour préparer l’ARN pour l’analyse du transcriptome et pour la physiologie. Cette approche a été utilisée pour étudier le transcriptome du sac endolymphatique, soit dans son ensemble, soit dans l’analyse de séquençage d’ARN sur cellule unique afin de contribuer à caractériser ses différents types de cellules.
