La cromatografia di esclusione dimensionale è un approccio utile per separare le sottopopolazioni di vescicole batteriche di dimensioni eterogenee e per rimuovere acidi nucleici e proteine dai supernatanti batterici. La cromatografia con esclusione dimensionale è meno costosa, più veloce e più riproducibile rispetto ad altre tecniche di separazione, inclusa l'ultracentrifugazione del gradiente di densità. Abbiamo dimostrato il potenziale di questo approccio utilizzando le vescicole di A.actinomycetemcomitans, ma ci aspettiamo che possa essere applicato anche ad altre popolazioni di vescicole batteriche di dimensioni eterogenee.
Assicurarsi di degasare correttamente tutte le soluzioni tampone e di perle e di pipettare la soluzione lentamente senza introdurre bolle ma abbastanza rapidamente da contenere le perle in modo omogeneo senza asciugarsi. Per iniziare, utilizzare un'asta di vetro per mescolare una bottiglia di terreno filtrante in gel e versare il volume necessario per riempire la colonna più circa il 50% in eccesso in una bottiglia di vetro. Lasciare sedimentare le pere e decantare il liquido in eccesso.
Riaspenire le perle nel tampone di eluizione in una soluzione finale di circa il 70% di gel e il 30% di tampone e degassare la soluzione sotto vuoto. Montare la colonna su un supporto ad anello in posizione verticale e riempire la colonna con un tampone di eluizione per bagnare le pareti prima di drenare il tampone fino a quando rimane solo un centimetro circa. Quindi pipettare con cura le perle di gel nella colonna mentre contemporaneamente drena il tampone in eccesso per evitare che le perle si depositino fino a quando la colonna non viene imballata ad un'altezza di circa due centimetri sotto il fondo del serbatoio della colonna.
Prima di caricare il campione, degassare il tampone di eluizione sotto vuoto. Lavare la colonna con circa due volte il volume della colonna del tampone di eluizione. Una volta che il tampone raggiunge la parte superiore dello strato di gel, aggiungere con attenzione due millilitri di un campione di vescicola a membrana esterna da 100 a 200 nanomolari per litro sopra lo strato di gel senza disturbare la superficie e lasciare che il campione entri nel gel.
Aggiungere lentamente il tampone di eluizione alla colonna senza disturbare lo strato di gel e posizionare un tubo da 50 millilitro sotto la colonna. Per evitare che la colonna si secchi, aggiungere contemporaneamente il tampone di eluizione nella parte superiore della colonna. Dopo aver raccolto 20 millilitri di eluato, posizionare un rack di tubi da 1,5 millilitri sotto la colonna.
Raccogli un totale di 96 frazioni di un millilitro in ogni tubo. Durante la raccolta dei campioni, aggiungere continuamente il buffer di eluizione alla colonna. Per pulire la colonna, eseguire un volume di colonna di idrossido di sodio molare 0,1 attraverso la colonna seguito da due volumi di colonna di tampone di eluizione.
Per misurare le concentrazioni lipidiche, pipettare 50 microlitri di ogni frazione in una piastra da 96 pozzetti. Aggiungere 2,5 microlitri di colorante lipofilo a ciascun pozzo. Dopo 15 secondi, misurare l'intensità di fioritura.
Per misurare la concentrazione di una proteina di interesse, aggiungere 100 microlitri di ogni frazione in singoli pozzetti di una piastra immuno ELISA. Dopo tre ore a 25 gradi Celsius, decantare il contenuto della piastra. Lavare la piastra cinque volte con 200 microlitri di tampone elisa per lavaggio decantando la piastra dopo ogni lavaggio.
Aggiungere 200 microlitri di tampone di blocco a ciascun pozzezza per un'incubazione di un'ora a 25 gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, decantare la piastra e aggiungere 100 microlitri di anticorpi primari in tampone bloccante per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, decantare la piastra e lavare la piastra cinque volte con il tampone di lavaggio ELISA come dimostrato.
Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 100 microlitri di anticorpi secondari nel tampone di lavaggio ELISA a ciascun pozzetto per un'incubazione di un'ora a 25 gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, lavare la piastra come dimostrato e aggiungere 100 microlitri di soluzione TMB a ciascun pozzetti per un'incubazione da 15 a 30 minuti a temperatura ambiente. Quando si sviluppa un colore blu, aggiungere 50 microlitri di soluzione di arresto a ciascun pozzetaggio e misurare l'assorbanza a 450 nanometri.
Dopo la purificazione della colonna di esclusione dimensionale di un surnatante di coltura di A.actinomycetemcomitans come dimostrato, sono stati osservati due picchi lipidici distinti, corrispondenti alle vescicole di membrana esterna grandi e piccole prodotte da questo ceppo. L'analisi ELISA delle frazioni campione ha rivelato che la tossina è associata principalmente alla sottopopolazione di grandi vescicole di membrana esterna. L'analisi immuno blot ha dato risultati simili ma più rumorosi, indicando che questo approccio è meno sensibile di ELISA.
Come osservato, questa tecnica di cromatografia è in grado di rimuovere quantità significative di proteine libere dai preparati delle vescicole della membrana esterna. Tuttavia, è importante notare che la concentrazione totale di proteine non è necessariamente correlata alla concentrazione di proteine specifiche. È importante fare molta attenzione durante l'imballaggio e il funzionamento della colonna per evitare bolle e per evitare che la colonna si secchi.
La diffusione dinamica della luce, il tracciamento delle particelle e la bicroscopia possono essere eseguiti dopo la cromatografia di esclusione dimensionale per determinare le dimensioni e altre caratteristiche delle vescicole della membrana esterna separate.
