Хроматография исключения размеров является полезным подходом для разделения субпопуляций бактериальных везикул гетерогенного размера и для удаления нуклеиновых кислот и белков из бактериальных супернатантов. Хроматография с исключением размеров дешевле, быстрее и более воспроизводима, чем другие методы разделения, включая ультрацентрифугирование градиента плотности. Мы продемонстрировали потенциал этого подхода с использованием везикул A.actinomycetemcomitans, но мы ожидаем, что он может быть применен и к другим популяциям бактериальных везикул гетерогенного размера.
Убедитесь, что вы правильно дегазируете все буферные и бисероплеты растворы и медленно пипетирует раствор, не вводя пузырьков, но достаточно быстро, чтобы шарики упаковывали однородно, не высыхая. Для начала используйте стеклянный стержень, чтобы смешать бутылку с гелевой фильтрующей средой и налить объем, необходимый для заполнения колонки плюс примерно 50% избытка в стеклянную бутылку. Дайте бусинам отстояться и декантировать лишнюю жидкость.
Повторно суспендировать шарики в буфере элюдения до конечного раствора приблизительно 70% геля и 30% буфера и дегазировать раствор под вакуумом. Установите колонну на кольцевую стойку в вертикальном положении и заполните колонну буфером элюирования, чтобы смочить стены перед сливом буфера, пока не останется всего около одного сантиметра. Затем осторожно высыпяйте гелевые шарики в колонну, одновременно сливая избыточный буфер, чтобы предотвратить оседание бусин до тех пор, пока колонна не будет упакована на высоту примерно двух сантиметров ниже дна резервуара колонны.
Перед загрузкой образца дегазуют буфер элюения под вакуумом. Промывайте колонку примерно в два раза больше, чем буфер элюира. Как только буфер достигнет верхней части слоя геля, осторожно добавьте два миллилитра от 100 до 200 наномоляр на литр образца емезикул наружной мембраны поверх слоя геля, не нарушая поверхность, и позвольте образцу войти в гель.
Медленно добавьте буфер элюдения в колонку, не нарушая слой геля, и поместите под колонну трубку размером 50 миллилитров. Чтобы предотвратить высыхание колонны, одновременно добавьте буфер элюирования в верхнюю часть колонны. После сбора 20 миллилитров элюата поместите под колонну стойку из 1,5 миллилитровых трубок.
Соберите в общей сложности 96 одномилитровых фракций в каждой трубке. При сборе образцов непрерывно добавляйте в столбец буфер элюирования. Чтобы очистить столбец, проведите через столбец с объемом 0,1 молярного гидроксида натрия, а затем два объема колонны буфера элюдения.
Для измерения концентрации липидов пипетку 50 микролитров каждой фракции в 96 луночную пластину. Добавьте в каждую лунку 2,5 микролитра липофильного красителя. Через 15 секунд измерьте интенсивность цветения.
Чтобы измерить концентрацию интересующего белка, добавьте 100 микролитров каждой фракции в отдельные лунки ИФА-иммунопластицы. Через три часа при 25 градусах Цельсия декантирует содержимое пластины. Мойте тарелку пять раз с помощью 200 микролитров буфера для промывки ИФА на одну промывку, декантируя пластину после каждой стирки.
Добавьте 200 микролитров блокирующего буфера в каждую лунку в течение одного часа инкубации при 25 градусах Цельсия. В конце инкубации декантируют пластину и добавляют 100 микролитров первичного антитела в блокирующий буфер для ночной инкубации при четырех градусах Цельсия. На следующий день декантируем пластину и вымойте ее пять раз с помощью буфера для промывки ИФА, как показано на продемонстрированной.
После последней промывки добавьте 100 микролитров вторичного антитела в буфер промывки ИФА в каждую лунку для одночасовой инкубации при 25 градусах Цельсия. В конце инкубации промыть пластину, как показано на демонстрации, и добавить 100 микролитров раствора TMB в каждую лунку для инкубации от 15 до 30 минут при комнатной температуре. Когда разовьется синий цвет, добавьте в каждую лунку 50 микролитров стопорного раствора и измерьте поглощение на 450 нанометрах.
После очистки колонки исключения размеров супернатанта культуры A.actinomycetemcomitans, как показано, наблюдались два отчетливых липидных пика, соответствующих большим и малым везикулам наружной мембраны, продуцируемым этим штаммом. ИФА-анализ фракций образца показал, что токсин связан в первую очередь с субпопуляцией больших везикул наружной мембраны. Анализ иммуноблонатов дал аналогичные, но более шумные результаты, что указывает на то, что этот подход менее чувствителен, чем ИФА.
Как было замечено, этот метод хроматографии способен удалять значительные количества свободных белков из препаратов везикул наружной мембраны. Однако важно отметить, что общая концентрация белка не обязательно коррелирует с концентрацией конкретных белков. Важно быть очень осторожным во время упаковки и работы колонны, чтобы избежать пузырьков и предотвратить высыхание колонны.
Динамическое рассеяние света, отслеживание частиц и бикроскопия могут быть выполнены после хроматографии исключения размера для определения размера и других характеристик разделенных наружных мембранных везикул.
