La cromatografía de exclusión de tamaño es un enfoque útil para separar las subpoblaciones de vesículas bacterianas de tamaño heterogéneo y para eliminar ácidos nucleicos y proteínas de sobrenadantes bacterianos. La cromatografía de exclusión de tamaño es menos costosa, más rápida y más reproducible que otras técnicas de separación, incluida la ultracentrifugación por gradiente de densidad. Hemos demostrado el potencial de este enfoque utilizando vesículas de A.actinomycetemcomitans, pero esperamos que también pueda aplicarse a otras poblaciones de vesículas bacterianas de tamaño heterogéneo.
Asegúrese de desgascarar adecuadamente todas las soluciones tampón y de perlas y de pipetear la solución lentamente sin introducir burbujas, pero lo suficientemente rápido como para que las perlas se empaquetan de manera homogénea sin secarse. Para comenzar, use una varilla de vidrio para mezclar una botella de material de medio de filtración de gel y vierta el volumen requerido para llenar la columna más aproximadamente el 50% de exceso en una botella de vidrio. Deje que las perlas se asienten y decanten el exceso de líquido.
Resuspend las perlas en tampón de elución a una solución final de aproximadamente 70% de gel y 30% de tampón y desgasifica la solución al vacío. Monte la columna en un soporte de anillo en la posición vertical y llene la columna con tampón de elución para humedecer las paredes antes de drenar el tampón hasta que solo quede aproximadamente un centímetro. Luego, pipetee cuidadosamente las perlas de gel en la columna mientras drena simultáneamente el exceso de tampón para evitar que las perlas se asienten hasta que la columna se empaquete a una altura de aproximadamente dos centímetros por debajo de la parte inferior del depósito de la columna.
Antes de cargar la muestra, desgasifa el tampón de elución al vacío. Lave la columna con aproximadamente dos veces el volumen de columna del búfer de elución. Una vez que el tampón llegue a la parte superior de la capa de gel, agregue cuidadosamente dos mililitros de una muestra de vesícula de membrana externa de 100 a 200 nanomolares por litro en la parte superior de la capa de gel sin perturbar la superficie y deje que la muestra ingrese al gel.
Agregue lentamente el tampón de elución a la columna sin perturbar la capa de gel y coloque un tubo de 50 mililitros debajo de la columna. Para evitar que la columna se seque, agregue simultáneamente un tampón de elución a la parte superior de la columna. Después de recolectar 20 mililitros de eluado, coloque un estante de tubos de 1.5 mililitros debajo de la columna.
Recoge un total de 96 fracciones de un mililitro en cada tubo. Mientras recolecta las muestras, agregue continuamente un búfer de elución a la columna. Para limpiar la columna, ejecute un volumen de columna de hidróxido de sodio molar 0.1 a través de la columna seguido de dos volúmenes de columna de tampón de elución.
Para medir las concentraciones de lípidos, pipetee 50 microlitros de cada fracción en una placa de 96 pozos. Agregue 2.5 microlitros de tinte lipofílico a cada pozo. Después de 15 segundos, mida la intensidad de la florescencia.
Para medir la concentración de una proteína de interés, agregue 100 microlitros de cada fracción en los pozos individuales de una placa de inmuno ELISA. Después de tres horas a 25 grados centígrados, decantar el contenido de la placa. Lave la placa cinco veces con 200 microlitros de tampón de lavado ELISA por lavado decantando la placa después de cada lavado.
Agregue 200 microlitros de tampón de bloqueo a cada pozo durante una incubación de una hora a 25 grados centígrados. Al final de la incubación, decantar la placa y agregar 100 microlitros de anticuerpo primario en tampón de bloqueo para una incubación nocturna a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, decantar la placa y lavar la placa cinco veces con tampón de lavado ELISA como se demuestra.
Después del último lavado, agregue 100 microlitros de anticuerpo secundario en tampón de lavado ELISA a cada pozo durante una incubación de una hora a 25 grados centígrados. Al final de la incubación, lave la placa como se ha demostrado y agregue 100 microlitros de solución TMB a cada pozo durante una incubación de 15 a 30 minutos a temperatura ambiente. Cuando se desarrolle un color azul, agregue 50 microlitros de solución de parada a cada pozo y mida la absorbancia a 450 nanómetros.
Después de la purificación de la columna de exclusión de tamaño de un sobrenadante de cultivo de A.actinomycetemcomitans como se demostró, se observaron dos picos lipídicos distintos, correspondientes a las vesículas de membrana externa grandes y pequeñas producidas por esta cepa. El análisis ELISA de las fracciones de la muestra reveló que la toxina se asocia principalmente con la subpoblación de grandes vesículas de membrana externa. El análisis de immuno blot dio resultados similares pero más ruidosos, lo que indica que este enfoque es menos sensible que el ELISA.
Como se ha observado, esta técnica de cromatografía es capaz de eliminar cantidades significativas de proteínas libres de las preparaciones de las vesículas de la membrana externa. Sin embargo, es importante tener en cuenta que la concentración total de proteínas no necesariamente se correlaciona con la concentración de proteínas específicas. Es importante tener mucho cuidado durante el embalaje y el funcionamiento de la columna para evitar burbujas y evitar que la columna se seque.
La dispersión dinámica de la luz, el seguimiento de partículas y la bicroscopia se pueden realizar después de la cromatografía de exclusión de tamaño para determinar el tamaño y otras características de las vesículas de membrana externa separadas.
