크기 배제 크로마토그래피는 이질적으로 크기의 세균 성 소포의 하위 집단을 분리하고 세균 성 초자연체에서 핵산과 단백질을 제거하기위한 유용한 접근 방식입니다. 크기 배제 크로마토그래피는 밀도 그라데이션 초원심 분리를 포함한 다른 분리 기술보다 저렴하고 빠르며 재현이 가능합니다. 우리는 A.actinomycetemcomitans 소포를 사용하여 이 접근의 잠재력을 보여주었습니다, 그러나 우리는 또한 그밖 이기질 크기의 세균성 소포 인구에 적용될 수 있었다는 것을 예상합니다.
모든 버퍼와 비드 솔루션을 제대로 탈착하고 거품을 도입하지 않고 천천히 솔루션을 피펫해야하지만 비드가 건조하지 않고 균일하게 포장 할 만큼 빨리. 먼저 유리 막대를 사용하여 젤 여과 매체의 스톡 병을 혼합하고 컬럼을 채우는 데 필요한 부피를 유리 병에 약 50%의 초과물을 붓습니다. 구슬이 여분의 액체를 정착시키고 데큰란트하도록 허용합니다.
용출 버퍼에서 구슬을 약 70% 젤 및 30%의 버퍼로 재연하고 진공 상태에서 용액을 탈가스합니다. 기둥을 수직 위치에 있는 링 스탠드에 장착하고 열을 용해 버퍼로 채우고 벽을 적시고 버퍼를 약 1센티미터만 유지할 때까지 버퍼를 배수합니다. 그런 다음 열 저장소 의 바닥 아래 약 2 센티미터높이로 열이 포장 될 때까지 구슬이 침전되는 것을 방지하기 위해 과도한 버퍼를 배수하면서 젤 구슬을 조심스럽게 열로 피펫합니다.
시료를 로드하기 전에 용출 버퍼를 진공 상태에서 탈가스로 변환합니다. 용출 버퍼의 약 2배의 열 부피로 컬럼을 세척합니다. 버퍼가 젤 층의 상단에 도달하면, 조심스럽게 표면을 방해하지 않고 젤 층 위에 리터 외부 멤브레인 소포 샘플 당 100 ~ 200 나노 몰라의 두 밀리리터를 추가하고 샘플이 젤에 들어가게한다.
젤 층을 방해하지 않고 컬럼에 용출 버퍼를 천천히 추가하고 컬럼 아래에 50 밀리리터 튜브를 놓습니다. 열이 건조되지 않도록 하려면 동시에 열 상단에 용출 버퍼를 추가합니다. 20 밀리리터의 용루를 수집한 후 컬럼 아래에 1.5 밀리리터 튜브랙을 놓습니다.
각 튜브에 총 96 개의 1 밀리 리터 분획을 수집합니다. 샘플을 수집하는 동안 열에 용출 버퍼를 지속적으로 추가합니다. 컬럼을 청소하려면 컬럼을 통해 수산화 나트륨0.1의 열 부피를 한 다음 두 개의 열 볼륨의 용출 버퍼를 실행합니다.
지질 농도를 측정하기 위해 각 분획의 파이펫 50 마이크로리터를 96개의 웰 플레이트로 넣습니다. 각 웰에 2.5 마이크로리터의 리포마이트 염료를 넣습니다. 15초 후, 꽃의 강도를 측정합니다.
관심 있는 단백질의 농도를 측정하려면 각 분획의 100마이크로리터를 ELISA 면역 플레이트의 개별 우물에 추가합니다. 섭씨 25도에서 3 시간 후, 접시 내용물. 세척 할 때마다 접시를 탈수 하는 세척 당 ELISA 세척 버퍼의 200 마이크로 리터와 함께 접시를 5 번 세척.
25°C에서 1시간 동안 각 웰에 200마이크로리터의 블로킹 버퍼를 추가합니다. 인큐베이션의 끝에서, 플레이트를 데킹하고 4섭씨에서 하룻밤 잠복에 대한 버퍼를 차단하는 1차 항체의 마이크로리터를 추가한다. 다음 날, 접시를 데치고 ELISA 세척 버퍼로 접시를 5 번 세척하는 것으로 입증되었습니다.
마지막 세척 후, ELISA 세척 버퍼에 이차 항체의 100 마이크로리터를 섭씨 25도에서 1시간 배양에 각각 양립할 수 있습니다. 인큐베이션이 끝나면, 입증된 대로 플레이트를 세척하고 실온에서 15~30분 동안 각 웰에 100마이크로리터의 TMB 용액을 추가합니다. 파란색이 발달하면 각 웰에 50 마이크로리터의 정지 용액을 추가하고 450 나노미터에서 흡광도를 측정합니다.
A.actinomycetemcomitans 배양 체퍼넌트의 크기 배제 컬럼 정화 후, 이 균주에 의해 생성된 크고 작은 외부 막 소포에 대응하는 두 개의 뚜렷한 지질 봉우리가 관찰되었다. 샘플 분획의 ELISA 분석은 독소가 주로 큰 외부 막 소포의 하위 집단과 연관되어 있음을 밝혔다. 면역 얼룩 분석은 이 접근이 ELISA 보다는 보다 더 적게 민감하다는 것을 나타내는 유사하지만 더 시끄러운 결과를 주었습니다.
관찰된 바와 같이, 이 크로마토그래피 기술은 외부 막 소포의 준비에서 상당한 양의 무료 단백질을 제거할 수 있습니다. 그러나, 총 단백질 농도 반드시 특정 단백질의 농도와 상관 관계가 되지 않습니다 주의 하는 것이 중요 하다. 기둥의 포장 및 실행 중에 거품을 피하고 기둥이 건조되는 것을 방지하는 것이 중요합니다.
다이나믹 광 산란, 입자 추적 및 이두산 법은 분리된 외부 멤브레인 소포의 크기 및 기타 특성을 결정하기 위해 크기 배제 크로마토그래피를 수행할 수 있다.
