Die Größenausschlusschromatographie ist ein nützlicher Ansatz, um die Subpopulationen heterogen großer Bakterienvesikel zu trennen und Nukleinsäuren und Proteine aus bakteriellen Überständen zu entfernen. Die Größenausschlusschromatographie ist kostengünstiger, schneller und reproduzierbarer als andere Trenntechniken, einschließlich der Dichtegradienten-Ultrazentrifugation. Wir haben das Potenzial dieses Ansatzes mit A.actinomycetemcomitans Vesikelnen demonstriert, aber wir erwarten, dass es auch auf andere heterogene bakterielle Vesikelpopulationen angewendet werden könnte.
Achten Sie darauf, alle Puffer- und Perlenlösungen richtig zu entgasen und die Lösung langsam zu pipetetten, ohne Blasen einzuführen, aber schnell genug, dass sich die Perlen homogen verpacken, ohne auszutrocknen. Verwenden Sie zunächst einen Glasstab, um eine Vorratsflasche mit Gelfiltrationsmedium zu mischen und das zum Füllen der Säule erforderliche Volumen plus etwa 50% Überschuss in eine Glasflasche zu gießen. Lassen Sie die Perlen absetzen und dekantieren Sie die überschüssige Flüssigkeit.
Die Perlen im Elutionspuffer zu einer von ca. 70% Gel und 30% Puffer resuspendieren und die Lösung unter Vakuum entgasen. Montieren Sie die Säule auf einem Ringständer in vertikaler Position und füllen Sie die Säule mit Elutionspuffer, um die Wände zu benetzen, bevor Sie den Puffer entleeren, bis nur noch etwa ein Zentimeter übrig ist. Dann pipetetten Sie die Gelperlen vorsichtig in die Säule und entleeren gleichzeitig den überschüssigen Puffer, um zu verhindern, dass sich die Perlen absetzen, bis die Säule auf eine Höhe von etwa zwei Zentimetern unter dem Boden des Säulenbehälters gepackt ist.
Bevor Sie die Probe laden, entgasen Sie den Elutionspuffer unter Vakuum. Waschen Sie die Säule mit etwa dem Zweifachen des Säulenvolumens des Elutionspuffers. Sobald der Puffer die Oberseite der Gelschicht erreicht hat, fügen Sie vorsichtig zwei Milliliter einer 100 bis 200 Nanomolar pro Liter äußeren Membranvesikelprobe auf die Gelschicht hinzu, ohne die Oberfläche zu stören, und lassen Sie die Probe in das Gel eindringen.
Fügen Sie den Elutionspuffer langsam zur Säule hinzu, ohne die Gelschicht zu stören, und legen Sie ein 50-Milliliter-Röhrchen unter die Säule. Um zu verhindern, dass die Säule austrocknet, fügen Sie gleichzeitig einen Elutionspuffer an der Oberseite der Säule hinzu. Nachdem Sie 20 Milliliter Eluat gesammelt haben, legen Sie ein Rack mit 1,5 Milliliter-Röhrchen unter die Säule.
Sammeln Sie insgesamt 96 Ein-Milliliter-Fraktionen in jedem Röhrchen. Fügen Sie während der Probensammlung der Säule kontinuierlich einen Elutionspuffer hinzu. Um die Säule zu reinigen, führen Sie ein Säulenvolumen von 0,1 molarem Natriumhydroxid durch die Säule, gefolgt von zwei Säulenvolumina mit Elutionspuffer.
Um die Lipidkonzentrationen zu messen, pipetten Sie 50 Mikroliter jeder Fraktion in eine 96-Well-Platte. Fügen Sie 2,5 Mikroliter lipophilen Farbstoff zu jeder Vertiefung hinzu. Messen Sie nach 15 Sekunden die Floreszenzintensität.
Um die Konzentration eines interessierenden Proteins zu messen, fügen Sie 100 Mikroliter jeder Fraktion in einzelne Vertiefungen einer ELISA-Immunplatte hinzu. Nach drei Stunden bei 25 Grad Celsius den Platteninhalt dekantieren. Waschen Sie die Platte fünfmal mit 200 Mikrolitern ELISA-Waschpuffer pro Waschgang und dekantieren Sie die Platte nach jeder Wäsche.
Fügen Sie 200 Mikroliter Blockierpuffer zu jeder Vertiefung für eine Stunde Inkubation bei 25 Grad Celsius hinzu. Am Ende der Inkubation dekantieren Sie die Platte und fügen 100 Mikroliter primären Antikörpers in Blockierungspuffer für eine Inkubation über Nacht bei vier Grad Celsius hinzu. Am nächsten Tag dekantieren Sie die Platte und waschen Sie die Platte fünfmal mit ELISA-Waschpuffer, wie gezeigt.
Nach der letzten Wäsche 100 Mikroliter sekundärer Antikörper in ELISA-Waschpuffer in jede Vertiefung für eine Stunde Inkubation bei 25 Grad Celsius geben. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Platte wie gezeigt und fügen Sie 100 Mikroliter TMB-Lösung für eine 15- bis 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur in jede Vertiefung ein. Wenn sich eine blaue Farbe entwickelt, fügen Sie 50 Mikroliter Stopplösung zu jeder Vertiefung hinzu und messen Sie die Absorption bei 450 Nanometern.
Nach der nachgewiesenen Reinigung der Größenausschlusssäule eines A.actinomycetemcomitans-Kulturüberstandes wurden zwei unterschiedliche Lipidpeaks beobachtet, die den großen und kleinen äußeren Membranvesikeln entsprechen, die von diesem Stamm produziert werden. Die ELISA-Analyse der Probenfraktionen ergab, dass das Toxin in erster Linie mit der Subpopulation großer äußerer Membranvesikel assoziiert ist. Die Immuno-Blot-Analyse ergab ähnliche, aber lautere Ergebnisse, was darauf hindeutet, dass dieser Ansatz weniger empfindlich ist als ELISA.
Wie beobachtet, ist diese Chromatographietechnik in der Lage, signifikante Mengen an freien Proteinen aus den Präparaten der äußeren Membranvesikel zu entfernen. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die Gesamtproteinkonzentration nicht unbedingt mit der Konzentration bestimmter Proteine korreliert. Es ist wichtig, beim Verpacken und Laufen der Säule sehr vorsichtig zu sein, um Blasen zu vermeiden und ein Austrocknen der Säule zu verhindern.
Dynamische Lichtstreuung, Partikelverfolgung und Bigoskopie können nach größenausschlusschromatographischer Spektaographie durchgeführt werden, um die Größe und andere Eigenschaften der getrennten äußeren Membranvesikel zu bestimmen.
