Boyut dışlama kromatografisi, heterojen boyuttaki bakteri veziküllerinin alt stoklamalarını ayırmak ve bakteriyel süpernatantlardan nükleik asitleri ve proteinleri çıkarmak için yararlı bir yaklaşımdır. Boyut dışlama kromatografisi, yoğunluk gradyan ultrasantrifüjleme de dahil olmak üzere diğer ayırma tekniklerine göre daha ucuz, daha hızlı ve daha tekrarlanabilir. Bu yaklaşımın potansiyelini A.actinomycetemcomitans vezikülleri kullanarak gösterdik, ancak diğer heterojen boyutlu bakteriyel vezikül popülasyonlarına da uygulanabileceğini umuyoruz.
Tüm tampon ve boncuk çözeltilerini düzgün bir şekilde gazdan arındırdığınızdan ve çözeltiyi kabarcıklar sokmadan yavaşça, ancak boncukların kurumadan homojen bir şekilde paketleyip paketleyip paketlemediğinizden emin olun. Başlamak için, bir şişe jel filtrasyon ortamını karıştırmak için bir cam çubuk kullanın ve sütunu doldurmak için gereken hacmi artı yaklaşık% 50 fazlalığı bir cam şişeye dökün. Boncukların yerleşmesine ve fazla sıvıyı dekante etmesine izin verin.
Yağ tamponundaki boncukları yaklaşık% 70 jel ve% 30 tampon nihai bir çözeltiye yeniden depolayın ve çözeltiyi vakum altında gazdan arındırın. Sütunu dikey konumda bir halka standına monte edin ve tamponu sadece bir santimetre kalana kadar boşaltmadan önce duvarları ıslatmak için sütunu elution tamponu ile doldurun. Daha sonra, boncukların sütun rezervuarının altında yaklaşık iki santimetre yüksekliğe kadar paketleninceye kadar çökeltilmesini önlemek için fazla tamponu boşaltırken jel boncukları sütuna dikkatlice pipetleyin.
Numuneyi yüklemeden önce, elution tamponu vakum altında gazdan arındırın. Sütunu, elution arabellek sütun hacminin yaklaşık iki katıyla yıkayın. Tampon jel tabakasının tepesine ulaştığında, yüzeyi bozmadan jel tabakasının üzerine litre başına 100 ila 200 nanomoler membranlı numunenin iki mililitresini dikkatlice ekleyin ve numunenin jel içine girmesine izin verin.
Jel tabakasını bozmadan yağ tamponunu yavaşça sütuna ekleyin ve sütunun altına 50 mililitrelik bir tüp yerleştirin. Sütunun kurumasını önlemek için, aynı anda sütunun üstüne elution arabelleği ekleyin. 20 mililitre elüat topladıktan sonra, sütunun altına 1,5 mililitrelik bir tüp rafı yerleştirin.
Her tüpte toplam 96 bir mililitre fraksiyon toplayın. Örnekleri toplarken, sütuna sürekli olarak elution arabelleği ekleyin. Sütunu temizlemek için, sütun boyunca 0,1 molar sodyum hidroksitten oluşan bir sütun hacmi ve ardından iki sütun birimi elution arabelleği çalıştırın.
Lipit konsantrasyonlarını ölçmek için pipet her fraksiyonun 50 mikrolitresini 96 kuyu plakasına koyun. Her kuyuya 2,5 mikrolitre lipofilik boya ekleyin. 15 saniye sonra floresan yoğunluğunu ölçün.
İlgi çekici bir proteinin konsantrasyonunu ölçmek için, elisa immün plakanın bireysel kuyularına her fraksiyondan 100 mikrolitre ekleyin. 25 santigrat derecede üç saat sonra plaka içeriğini dekante edin. Her yıkamadan sonra plakayı dekante eden yıkama başına 200 mikrolitre ELISA yıkama tamponu ile plakayı beş kez yıkayın.
25 santigrat derecede bir saatlik inkübasyon için her kuyuya 200 mikrolitre bloklama tamponu ekleyin. Kuluçkanın sonunda, plakayı dekantasyona koyun ve dört santigrat derecede bir gecelik inkübasyon için bloke tampona 100 mikrolitre birincil antikor ekleyin. Ertesi gün, plakayı dekantlayın ve gösterildiği gibi ELISA yıkama tamponu ile plakayı beş kez yıkayın.
Son yıkamadan sonra, ELISA yıkama tamponunda 100 mikrolitre ikincil antikoru her kuyuya 25 santigrat derecede bir saatlik inkübasyon için ekleyin. Kuluçkanın sonunda, plakayı gösterildiği gibi yıkayın ve oda sıcaklığında 15 ila 30 dakikalık bir inkübasyon için her kuyuya 100 mikrolitre TMB çözeltisi ekleyin. Mavi bir renk geliştiğinde, her kuyuya 50 mikrolitre durdurma çözeltisi ekleyin ve emiciliği 450 nanometrede ölçün.
Bir A.actinomycetemcomitans kültür süpernatantının boyut dışlama sütun saflaştırmasından sonra, bu suş tarafından üretilen büyük ve küçük dış zar veziklinlere karşılık gelen iki farklı lipid zirvesi gözlenmiştir. Örnek fraksiyonların ELISA analizi, toksinin öncelikle büyük dış zar veziklinlerin subpopülasyonu ile ilişkili olduğunu ortaya koydu. İmmün blot analizi benzer ama daha gürültülü sonuçlar verdi ve bu yaklaşımın ELISA'dan daha az hassas olduğunu gösterdi.
Gözlemlendiği gibi, bu kromatografi tekniği dış zar veziklin preparatlarından önemli miktarda serbest proteini uzaklaştırabilir. Bununla birlikte, toplam protein konsantrasyonunun belirli proteinlerin konsantrasyonu ile mutlaka ilişkili olmadığını belirtmek önemlidir. Kabarcıkları önlemek ve sütunun kurumasını önlemek için sütunun paketlenme ve çalıştırılması sırasında çok dikkatli olmak önemlidir.
Ayrılan dış zar veziklinlerin boyutunu ve diğer özelliklerini belirlemek için dinamik ışık saçılımı, partikül takibi ve bikroskopi, boyut dışlama kromatografisini takiben yapılabilir.
