私たちのシステムにより、研究者は、スケールされていない変位で十分に制御された特性を持つ非局在振動を呼び起こし、振動に対する刺激物の応答中のカルシウム電流を定量化することができます。この技術の主な利点として、行動の根底にある神経メカニズムを非侵襲的に調査することができます。セルスプレッダーを用いて、エシェリヒア・コリOP50が四角いパターンで縞模様になっている新しい線虫増殖培地またはNGMプレートを作製し、カルシウムイメージング中にワームが細菌にほとんどの時間を費やすようにする。
カルシウムイメージング実験の4日前に、2匹の成虫ST12ワームをプレート上に移し、プレートを摂氏20度のインキュベーターに4日間置いた。刺激用の音響トランスデューサ装置、2倍の対物レンズ、高速CMOSカメラ、画像分割光学系を備えた顕微鏡を用いてカルシウムイメージングを行う。X Y 電動ステージコントローラーの精密コンピューターの電源を入れます。
次に、アンプの電源を入れ、音量調整器をベースで10に、高音調整器を8に設定します。GCaMP を励起し、RFP にタグを付けるには、LED 光源の 488 ナノメートルと 560 ナノメートルのライトをオンにします。光源のコントロールポッドの470ナノメートルと550ナノメートルのゲージを5%に設定して、LEDライトの強度がイメージングに適するようにします。
以下のソフトウェア・パッケージおよびウィンドウをダウンロードしてインストールします。マウスマクロソフトウェア、振動制御用ソフトウェア、トラッキング実行用ソフトウェア、データ解析用ソフトウェア。トラッキングソフトウェアファイルをダブルクリックし、露出時間を0.033秒に設定し、ビニングを2秒ずつ設定して、スムーズな画像取得を保証します。
実行ボタンをクリックし、ソフトウェアを安定させるために5分間待ちます。画像取得用の情報を入力します。たとえば、間隔なしで 500 個の画像を記録するには、[画像の合計] ボックスに 500 個、[画像] ボックスに 500 個、間隔ボックスに 0 と入力します。
取得ボタンをオンにした後、画像分割光学系を使用して蛍光画像を分割し、GCaMPチャンネルとタグRFPチャンネルをCMOSカメラの2つの半分に投影します。GCaMP の座標を校正し、RFP チャンネルにタグを付け、設定を保存します。次に、データファイルを出力するようにディレクトリを設定し、集録をオフにします。
アッセイを読む。マウスカーソルがそのファイル内の座標とスケジュールに基づいて制御されるように、マウスマクロシステムを備えたテキストファイルと振動制御のためのソフトウェアファイルをダブルクリックします。記録開始後、刺激までの待ち時間でマウスカーソルの座標を設定し、振動制御用ソフトウェアで周波数と振幅値を設定します。
GCaMPとタグRFPの両方を発現する単一のワームを、インキュベートプレートから、大腸菌OP50が縞模様になっている新鮮なNGMプレートに移す。透明粘着テープを使用してNGMプレートを音響探触子に取り付けます。カルシウムイメージングの場合は、取得ボタンをオンにして、2.5倍の倍率でワームを見つけます。
視野を 1.1 x 1.1 ミリメートルに設定し、解像度はピクセルあたり 2.6 ミクロンに設定します。明るい光をオフにし、ホーミングボタンをクリックしてワームの蛍光スポットを追跡し、XYステージの動きを開始して、ワームの最大強度領域をタグRFP画像の視野の中央に保ちます。強度の値が約 1000 であることを確認します。
そうでない場合は、光源のコントロールポッドの470ナノメートルと550ナノメートルのゲージを微調整します。マウスマクロシステムで実行ボタンを押してマウスカーソルを制御できるようにし、出力BMPファイルが適切に作成されていることを確認します。データ分析のために、デスクトップ上にフォルダを作成し、それをカルシウムイメージング"と名付け、カルシウムイメージングフォルダ内にフォルダを作成し、出力結果ファイルのCI結果という名前を付けます。
デュアルビューイメージングをダブルクリックします。データ解析ソフトに書き込まれたMBファイル、およびBMPファイルのあるフォルダ内のCI結果フォルダへのファイルパスを挿入します。シフトキーとリターンキーを同時に押して自動解析を開始し、タグRFPイメージの最大強度領域の値を使用します。
最後に、出力ファイルが CI 結果フォルダーに適切に作成されているかどうかを確認します。代表的な解析では、GCaMPおよびタグRFPチャネルデータが一連の画像として得られた。非局在振動系によって誘導されたシャーレの変位も定量化した。
変位は、振動制御用のソフトウェア、およびボリュームアジャスターとアンプで振幅値を設定することによって制御することができます。一方、周波数はソフトウェアで周波数値を設定することで調整できます。630ヘルツの周波数と毎秒約4.5マイクロメートルの変位を有する振動による刺激時にAVAニューロンの一過性カルシウム応答が観察され、非局在刺激に対するワームの後方応答の間にAvaニューロンが活性化されたことを示している。
我々の手順では、単一のニューロンのみを定量化することができます。しかし、このシステムをバイオメトリックイメージング法と組み合わせて、複数のニューロンまたは脳全体を非侵襲的に定量化することもできる。
