Эта процедура литья и вставки силиконовых окон снижает технические барьеры для продольной прижизненной визуализации. Наш протокол производит прочные, легко адаптируемые окна, которые хорошо переносятся животными. Используя эту технику, мы изобразили раковые и иммунные клетки в печени, поджелудочной железе и молочной железе.
С минимальными корректировками он может быть адаптирован ко многим анатомическим местам и биологическим вопросам. Для тех, кто пробует эту технику впервые, практикуйте высвобождение небольшого количества клея из шприца. Применение слишком большого количества клея затуманивает поле визуализации и затрудняет работу с хирургической областью.
Начните отливку силиконового окна, нанеся небольшое количество свежеприготовленного силиконового полимера, полидиметилсилоксана, PDMS, на чистую гладкую поверхность и отрегулируйте отношение объема к площади, чтобы получить желаемую толщину. После того, как PDMS нанесен на желаемую поверхность литья, слегка вдавите сетку из нержавеющей стали в силикон, чтобы обеспечить ориентиры для повторного изображения одних и тех же областей ткани. Чтобы удалить пузырьки воздуха и дегазировать силиконовый полимер, поместите покрытую поверхность в вакуумный осушитель на 45 минут.
Когда это будет сделано, отвержьте полимер в духовке при температуре от 75 до 80 градусов Цельсия в течение 45 минут. Наметьте полимер по краям формы и используйте щипцы, чтобы аккуратно отклеить отвержденные окна с поверхности, используемой для литья. Поместите мышь в левое боковое пролежне.
Подготовьте анестезируемую мышь к операции, нанеся 10% объем по объему раствора повидона йода и 70% объем по объему этанола три раза подряд на бритый хирургический участок. Необходимо соблюдать осторожность для поддержания стерильного хирургического поля. Далее используйте стерильные ножницы и щипцы, чтобы сделать 10-миллиметровый разрез на правом фланге на три миллиметра ниже реберной дуги.
Удалите один квадратный сантиметр участка кожи и используйте вторую пару стерильных ножниц и щипцов, чтобы удалить участок брюшины, немного меньший, чем участок кожи. Нанесите небольшое количество хирургического клея на стерильную пластину колодца и извлеките его шприцем 31 калибра для нанесения на поверхность печени по краям области, подлежащей изображению, затем поместите окно на нужную область и крепко удерживайте его на печени в течение примерно двух минут, пока клей не высохнет. После складывания краев окна под брюшину нанесите небольшое количество хирургического клея на края окна, которые сейчас находятся под брюшиной, надавите на брюшину щипцами, чтобы закрепить ее к окну.
Аналогичным образом, запечатайте брюшину, нанеся небольшое количество хирургического клея, прежде чем надавить на кожу, затем нанесите клей по краям окна, чтобы создать ободок, который предотвратит рост кожи над окном. Чтобы вставить окно в поджелудочную железу, поместите мышь в правое боковое пролежне и сделайте разрез на левом фланге, прежде чем удалить участок брюшины, как показано ранее. Используя стерильные ватные тампоны, пропитанные стерильным физиологическим раствором, осторожно вытягивали селезенку, чтобы визуализировать поджелудочную железу.
Переместите поджелудочную железу с помощью увлажненных ватных тампонов, чтобы сделать большую площадь поверхности видимой через разрез. Как только к поджелудочной железе будет получен доступ, вставьте и запечатайте окно визуализации на нужной области, как объяснялось ранее. Чтобы получить доступ к молочной железе, поместите мышь в лежачее положение, и сделайте 10-миллиметровый разрез медиальным к одному из паховых сосков с помощью стерильных ножниц и щипцов.
Удалите участок кожи площадью 0,5 квадратных сантиметра над молочной железой, затем осторожно отделите молочную железу от кожи, распределив стерильные ножницы между двумя поверхностями, чтобы нарушить адгезию. Используйте шприц 31 калибра, чтобы нанести небольшое количество хирургического клея на поверхность молочной железы по краям области, подлежащей изображению. Расположите и крепко прижмите окно к молочной железе, пока клей не высохнет.
После складывания краев окна под кожу нанесите небольшое количество хирургического клея на края окна, которые сейчас находятся под кожей, и надавите на кожу щипцами, чтобы закрепить кожу на окне. Нанесите клей по краям окна, чтобы создать ободок, который предотвратит рост кожи над окном. Перед началом сеанса визуализации очистите окно от остатков мусора, аккуратно протерев его ватным тампоном, смоченным в 70% этаноле.
При использовании водной иммерсионной линзы нанесите ультразвуковой гель на окно, избегая пузырьков. Чтобы начать визуализацию, найдите и поместите сетку в фокус через глаз. Затем определите приблизительную глубину визуализации ткани, установив нижнюю часть сетки на ноль.
Информация поможет найти соответствующую Z-плоскость в последующих сеансах визуализации. Чтобы определить одно и то же местоположение в течение нескольких сеансов визуализации, используйте квадраты на сетке в качестве контрольной точки. Во время сеанса визуализации запишите ориентацию сетки и расположение каждого поля зрения, изображенного в сетке.
Сетка может использоваться для возврата к определенным областям сетки и полям визуализации для успешного выполнения сеансов визуализации. После каждого сеанса визуализации удалите любую остаточную среду погружения в линзы и мусор, осторожно протирая окно ватным тампоном, смоченным в 70% этаноле. Силиконовое окно позволяет захватывать динамическую инфильтрацию иммунных клеток с течением времени.
Репрезентативный анализ иллюстрирует инфильтрацию нейтрофилов в ремоделирующей ткани молочной железы на второй и четвертый дни. Силиконовое окно позволяет визуализировать опухоли в нескольких временных точках в течение нескольких недель после вставки окна. Окна, отлитые с 200 миллиграммами PDMS, как правило, лучше подходят для хирургической имплантации, поскольку они демонстрируют значительно большую прочность, чем окна, отлитые со 150 миллиграммами.
Следует отметить, что окна PDMS были не такими жесткими, как стандартное стекло, представленное модулем Юнга стеклянных окон, значительно превышающим PDMS. Введение окна в разные органы хорошо переносилось, так как большинство мышей продолжали набирать вес с течением времени. Самое главное, что нужно помнить при попытке этой процедуры, это полностью заклеить окно с помощью клея.
Это предотвращает инфекцию, высыхание тканей и смещение окна. После процедуры ортотопические инъекции могут быть сделаны через силиконовое окно, что позволяет исследователям изучать широкий спектр тем, таких как пролиферация клеток, взаимодействие клеток с клетками и терапевтическая эффективность.
