BSA抗原ゲルは、既存のコントロールを補完することができる十分に特徴付けられた再現性のあるIHC標準です。このプロトコルは、標準的な組織学およびIHC試薬および方法を使用して、既知の組成の再現性のある標準を作成します。これらのコントロールは、さまざまなラボが多くの診断関連アッセイのIHCアッセイを校正および標準化する機会を提供します。
ペプチドまたはタンパク質を溶解するのに適切な溶媒を見つけることが重要である。気泡を導入せずに抗原溶液とホルムアルデヒド溶液をすばやく混合するのは難しい場合があります。はじめに、5グラムのBSA粉末を14ミリリットルのPBSに、50ミリリットルの円錐管中で均一に分配されるまで混合することにより、20ミリリットルの25体積重量のBSA溶液を調製する。
溶液をボルテックスしてBSA粉末を溶解する。完全に溶解するために、溶液を摂氏4度で一晩保ちます。翌日、PBSで最終容量を20ミリリットルに調整します。
同様に、13ミリリットルのPBSに6.26グラムのBSA粉末を混合することにより、20ミリリットルの31.3体積重量%のBSA溶液を調製する。完全に溶解するための一晩インキュベーション後、PBSで最終容量を20ミリリットルに調整します。BSAホルムアルデヒド混合物がゲルを形成することをテストするには、ヒートブロックを摂氏85度に予熱します。
次に、700マイクロリットルの25%BSA溶液を700マイクロリットルの37%ホルムアルデヒドと混合します。気泡を発生させずに、5〜10秒以内に5回上下にピペッティングしてよく混ぜます。混合直後に、閉じたマイクロ遠心管を摂氏85度に予熱したヒートブロックに入れます。
10分後、ヒートブロックからチューブを取り外します。冷まして、ゲルが期待どおりに形成されたことを確認します。8本の1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブを準備し、明確にラベルを付けます。
次いで、5xペプチドストック溶液を調製し、リベラル化されたペプチドの全質量を60マイクロリットルの適切な溶媒に再懸濁することにより12.5ミリモル濃度を加える。溶液を観察して、ペプチドが完全に溶解していることを確認します。次に、必要に応じて溶媒を追加し、ペプチドの分子量、質量、および純度に応じて12.5ミリモルの溶液を作ります。
この例では、5xペプチドストックの最終容量は626.9マイクロリットルです。他のペプチドサンプルは、異なる最終容量を必要とする。次に、150マイクロリットルの1xペプチドストック溶液を調製し、30マイクロリットルの5xペプチドストックを120マイクロリットルの溶媒に希釈して2.5ミリモル濃度を加えます。
溶液を5秒間ボルテックスし、室温で遠心分離します。次に、1xペプチドストック140マイクロリットルを560マイクロリットルの31.3%BSA溶液に希釈することにより、700マイクロリットルの0.5ミリモルペプチドBSA溶液を調製します。ボルテックス後、溶液を室温で遠心分離する。
同様に、630マイクロリットルの25%BSA溶液に70マイクロリットルのペプチドBSA溶液を加えることにより、ペプチドBSAストックの4つの連続した10倍段階希釈を調製する。BSAペプチドゲルを調製するには、ペプチドBSA希釈液に37%ホルムアルデヒドを1対1の比率で加え、一度に1サンプルずつ作業します。気泡を発生させずに、5〜10秒以内に5回上下にピペッティングしてよく混ぜます。
混合後、閉じたマイクロ遠心チューブを摂氏85度のヒートブロックに10分間入れます。すべてのペプチドBSAおよびホルムアルデヒド溶液を調製して加熱した後、ゲルをベンチトップ上で5〜10分間冷却する。次に、清潔で柔軟な使い捨ての実験用スパチュラを使用して、マイクロ遠心チューブからゲルサンプルをワンピースで取り出します。
そして、サンプルごとに別々の容器を使用して、少なくとも15ミリリットルの中性緩衝ホルマリンを含む密閉容器に入れます。あるいは、新しい片刃のかみそりの刃を使用して、マイクロ遠心チューブの底を切り取り、空気または適切なプローブでゲルを底から押し出します。きれいな片刃のかみそりを使用して、ゲルコーンを厚さ約5ミリメートルの円筒形のディスクにトリミングします。
ディスクを生検ラップで包んだ後、1つの大きなゲルディスクを1つのカセットに入れ、残りのゲルディスクを一緒に2番目のカセットに入れて、組織マイクロアレイの構築に使用します。処理する前に、サンプルごとに別々の容器を使用して、ゲルあたり少なくとも15ミリリットルの10%中性緩衝ホルマリンにカセットゲルを入れます。次に、圧力と真空で大きな組織スケジュールに従って、自動化された組織学組織処理装置でゲルを処理します。
サンプル処理が完了したら、ティッシュプロセッサーからカセットを取り出し、パラフィン包埋センターに移動します。生検ラップからゲルを開梱した後、ゲルをパラフィンに埋め込むか、各サンプルを1枚のゲルディスクを15 x 15ミリメートルの小さな型に埋め込みます。そして残りのゲルディスクは、2番目の大きな型で一緒になります。
ペプチド希釈シリーズごとに、合計6つの個別のセクションを含む2つのスライドガラスを作成します。5つの希釈系列サンプルのそれぞれから1つのセクション、およびBSAのみ陰性対照サンプルからの1つのセクション。スライドを切片化して乾燥させた後、各ペプチド用に調製した2つのスライドを所望の一次抗体で染色する。
標準的な免疫組織化学プロトコルによると、各ゲルセクション内で比較的均一なシグナルが見られると予想されます。異なるゲルサンプルを用いて、ペプチド希釈に対応するシグナル強度の範囲を示す。BSAゲル組織マイクロアレイ構築のために、組織マイクロアレイの厚さ4マイクロメートルの切片を切断し、実験室の標準プロトコルに従ってウサギモノクローナル抗体で染色します。
検査によって得られた染色強度を定性的に評価するか、デジタル画像のスキャンと分析を定量的に購入します。適切な抗体と反応した後、陰性対照BSAのみのゲルサンプルは最小限のシグナルを示した。個々のゲルサンプルのシグナル強度は比較的均一であり、抗原濃度の増加とともに増加します。
MDA-MB-175細胞の10%以上が、かすかで完全に円周方向の膜染色を示します。対照的に、SKBR-3細胞の10%以上は、室温でも溶液がゲル化し始めるため、ホルムアルデヒドが添加されると迅速に機能する強烈な完全円周膜染色を示します。この方法を使用して、新しい抗体をテストするときにIHCコントロールを行い、テスト抗体がシグナルを示さない場合でも、アッセイが期待どおりに実行されたことを確信できるようにします。
組織または細胞株コントロールは本質的に可変です。合成抗原コントロールにより、特定のISD反応条件を変化させた場合の影響をより正確に測定することができます。
