BSA-Antigengele sind gut charakterisierte reproduzierbare IHC-Standards, die bestehende Kontrollen ergänzen können. Dieses Protokoll verwendet Standardhistologie- und IHC-Reagenzien und -Methoden, um reproduzierbare Standards bekannter Zusammensetzung herzustellen. Diese Kontrollen bieten verschiedenen Laboren die Möglichkeit, IHC-Assays für viele diagnostisch relevante Assays zu kalibrieren und zu standardisieren.
Es ist wichtig, ein geeignetes Lösungsmittel zu finden, um das Peptid oder Protein aufzulösen. Es kann schwierig sein, Antigen- und Formaldehydlösungen schnell zu mischen, ohne Blasen einzuführen. Um zu beginnen, bereiten Sie 20 Milliliter einer 25%igen BSA-Lösung vor, indem Sie fünf Gramm BSA-Pulver in 14 Milliliter PBS in einem 50-Milliliter-Konikuschen mischen, bis es gleichmäßig verteilt ist.
Wirbeln Sie die Lösung zum Auflösen des BSA-Pulvers. Bewahren Sie die Lösung über Nacht bei vier Grad Celsius auf, um sie vollständig aufzulösen. Am nächsten Tag stellen Sie das Endvolumen mit PBS auf 20 Milliliter ein.
In ähnlicher Weise werden 20 Milliliter einer BSA-Lösung mit 31,3 Volumenprozent hergestellt, indem 6,26 Gramm BSA-Pulver in 13 Milliliter PBS gemischt werden. Nach der Inkubation über Nacht zur vollständigen Auflösung das Endvolumen mit PBS auf 20 Milliliter einstellen. Um zu testen, ob die BSA-Formaldehydmischung ein Gel bildet, heizen Sie einen Heizblock auf 85 Grad Celsius vor.
Mischen Sie dann 700 Mikroliter der 25%BSA-Lösung mit 700 Mikrolitern 37%Formaldehyd. Mischen Sie gut, indem Sie innerhalb von fünf bis 10 Sekunden fünfmal auf und ab pipettieren, ohne Luftblasen zu erzeugen. Unmittelbar nach dem Mischen das geschlossene Mikrozentrifugenröhrchen in den auf 85 Grad Celsius vorgeheizten Heizblock legen.
Nach 10 Minuten das Röhrchen aus dem Heizblock nehmen. Lassen Sie es abkühlen und bestätigen Sie, dass sich das Gel wie erwartet gebildet hat. Bereiten Sie acht 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen vor und kennzeichnen Sie sie deutlich.
Dann bereiten Sie eine 5x Peptid-Stammlösung vor, fügen Sie eine Konzentration von 12,5 Millimolar hinzu, indem Sie die gesamte Masse des liberalisierten Peptids in 60 Mikroliter des entsprechenden Lösungsmittels resuspendieren. Beobachten Sie die Lösung, um sicherzustellen, dass das Peptid vollständig gelöst ist. Dann fügen Sie bei Bedarf ein zusätzliches Volumen Lösungsmittel hinzu, um eine 12,5-Millimolar-Lösung entsprechend dem Molekulargewicht, der Masse und der Reinheit der Peptide herzustellen.
In diesem Beispiel hat der 5-fache Peptidbestand ein Endvolumen von 626,9 Mikrolitern. Andere Peptidproben benötigen ein anderes Endvolumen. Als nächstes bereiten Sie 150 Mikroliter einer 1x Peptidstammlösung vor, fügen Sie eine Konzentration von 2,5 Millimolar hinzu, indem Sie 30 Mikroliter des 5x-Peptidvorrats in 120 Mikroliter des Lösungsmittels verdünnen.
Die Lösung fünf Sekunden lang durchwirbeln und bei Raumtemperatur zentrifugieren. Als nächstes bereiten Sie 700 Mikroliter einer 0,5 Millimolar Peptid-BSA-Lösung vor, indem Sie 140 Mikroliter des 1x-Peptidbestands in 560 Mikroliter der 31,3%igen BSA-Lösung verdünnen. Nach dem Vortexen die Lösung bei Raumtemperatur zentrifugieren.
In ähnlicher Weise werden vier aufeinanderfolgende 10-fache serielle Verdünnungen des Peptid-BSA-Stocks hergestellt, indem 70 Mikroliter der Peptid-BSA-Lösung zu 630 Mikrolitern der 25%igen BSA-Lösung hinzugefügt werden. Um die BSA-Peptidgele herzustellen, fügen Sie den Peptid-BSA-Verdünnungen 37% Formaldehyd in einem Verhältnis von eins zu eins hinzu, wobei jeweils eine Probe bearbeitet wird. Mischen Sie gut, indem Sie innerhalb von fünf bis 10 Sekunden fünfmal auf und ab pipettieren, ohne Luftblasen zu erzeugen.
Nach dem Mischen das geschlossene Mikrozentrifugenröhrchen für 10 Minuten in einen Kühlblock bei 85 Grad Celsius legen. Nachdem alle Peptid-BSA- und Formaldehydlösungen vorbereitet und erhitzt wurden, lassen Sie die Gele fünf bis 10 Minuten auf der Tischplatte abkühlen. Als nächstes entfernen Sie die Gelprobe mit einem sauberen, flexiblen Einweg-Laborspatel in einem Stück aus dem Mikrozentrifugenröhrchen.
Und legen Sie es in einen verschlossenen Behälter, der mindestens 15 Milliliter neutrales gepuffertes Formalin enthält, wobei für jede Probe ein separater Behälter verwendet wird. Alternativ können Sie mit einer neuen einschneidigen Rasierklinge den Boden des Mikrozentrifugenröhrchens abschneiden und das Gel mit Luft oder einer geeigneten Sonde von unten herausdrücken. Mit einem sauberen einschneidigen Rasiermesser schneiden Sie den Gelkegel in zylindrische Scheiben von etwa fünf Millimetern Dicke.
Nachdem Sie die Scheiben in eine Biopsiefolie gewickelt haben, legen Sie eine größere Gelscheibe in eine Kassette und die restlichen Gelscheiben zusammen in eine zweite Kassette zur Verwendung in der Gewebe-Microarray-Konstruktion. Vor der Verarbeitung legen Sie die Kassettengele in mindestens 15 Milliliter 10% neutrales gepuffertes Formalin pro Gel, wobei für jede Probe ein separater Behälter verwendet wird. Als nächstes verarbeiten Sie die Gele in einem automatisierten histologischen Gewebeprozessor nach einem großen Gewebeplan mit Druck und Vakuum.
Wenn die Probenverarbeitung abgeschlossen ist, entnehmen Sie die Kassetten aus dem Gewebeprozessor und bringen Sie sie in das Paraffin-Einbettzentrum. Nachdem Sie die Gele aus der Biopsieverpackung ausgepackt haben, betten Sie die Gele in Paraffin ein oder betten Sie für jede Probe eine Gelscheibe in eine kleine 15 x 15 Millimeter große Form ein. Und die restlichen Gelscheiben zusammen in einer zweiten größeren Form.
Erstellen Sie für jede Peptidverdünnungsserie zwei Objektträger mit insgesamt sechs separaten Abschnitten. Ein Abschnitt aus jeder der fünf Verdünnungsserienproben und ein Abschnitt aus der BSA-Negativkontrollprobe. Nach dem Schneiden und Trocknen der Objektträger die beiden Objektträger, die für jedes Peptid vorbereitet wurden, mit dem gewünschten primären Antikörper färben.
Nach Standardprotokollen der Immunhistochemie erwarten Sie ein relativ gleichmäßiges Signal innerhalb jedes Gelabschnitts. Die verschiedenen Gelproben zeigen einen Bereich der Signalintensität, der den Peptidverdünnungen entspricht. Für die BSA-Gel-Gewebe-Microarray-Konstruktion schneiden Sie vier Mikrometer dicke Abschnitte des Gewebe-Microarrays ab und färben Sie sie mit einem monoklonalen Kaninchen-Antikörper gemäß Laborstandardprotokollen.
Beurteilen Sie die resultierende Fleckenintensität qualitativ durch Inspektion oder kaufen Sie quantitativ digitales Scannen und Analysieren. Nach Reaktion mit den entsprechenden Antikörpern zeigten die BSA-Negativkontroll-BSA-Gelproben nur ein minimales Signal. Die Signalintensität in einer einzelnen Gelprobe ist relativ gleichmäßig und nimmt mit steigenden Antigenkonzentrationen zu.
Mehr als 10% der MDA-MB-175-Zellen zeigen schwache und vollständig umlaufende membranöse Färbungen. Im Gegensatz dazu zeigen mehr als 10% der SKBR-3-Zellen eine intensive, vollständig umlaufende membranöse Färbung Arbeiten Sie schnell, sobald das Formaldehyd hinzugefügt wurde, da die Lösungen bereits bei Raumtemperatur zu gelieren beginnen. Wir verwenden diese Methode, um IHC-Kontrollen beim Testen neuer Antikörper durchzuführen, um uns die Sicherheit zu geben, dass der Assay wie erwartet funktioniert, auch wenn die Testantikörper kein Signal zeigen.
Gewebe- oder Zelllinienkontrollen sind von Natur aus variabel. Synthetische Antigenkontrollen ermöglichen es uns, den Effekt von sich ändernden spezifischen ISD-Reaktionsbedingungen genauer zu messen.
