Антигенные гели BSA хорошо характеризуются воспроизводимыми стандартами IHC, которые могут дополнять существующие средства контроля. Этот протокол использует стандартные гистологические и IHC реагенты и методы для создания воспроизводимых стандартов известного состава. Эти средства контроля дают возможность различным лабораториям калибровать и стандартизировать анализы IHC для многих диагностически значимых анализов.
Важно найти подходящий растворитель для растворения пептида или белка. Может быть сложно быстро смешивать растворы антигена и формальдегида без введения пузырьков. Для начала приготовьте 20 миллилитров 25%-ной массы по объему раствора BSA, смешав пять граммов порошка BSA в 14 миллилитрах PBS, в конической трубке объемом 50 миллилитров до равномерного распределения.
Вихрь раствора для растворения порошка BSA. Держите раствор на ночь при четырех градусах Цельсия для полного растворения. На следующий день отрегулируйте конечный объем до 20 миллилитров с помощью PBS.
Аналогично, приготовьте 20 миллилитров 31,3% веса по объему раствора BSA, смешивая 6,26 г порошка BSA в 13 миллилитрах PBS. После ночной инкубации для полного растворения отрегулируйте конечный объем до 20 миллилитров с помощью PBS. Чтобы проверить, что формальдегидная смесь BSA образует гель, разогрейте тепловой блок до 85 градусов цельсия.
Затем смешайте 700 микролитров 25%-ного раствора BSA с 700 микролитрами 37%-ного формальдегида. Хорошо перемешайте, пипетируя вверх и вниз пять раз в течение пяти-10 секунд без образования пузырьков воздуха. Сразу после перемешивания поместите закрытую микроцентрифужную трубку в тепловой блок, предварительно нагретый до 85 градусов Цельсия.
Через 10 минут снимите трубку с теплового блока. Дайте ему остыть и подтвердите, что гель сформировался, как и ожидалось. Подготовьте и четко маркируйте восемь 1,5-миллилитровых микроцентрифужных трубок.
Затем готовят 5-кратный раствор пептидного сырья, добавляют 12,5 миллимолярную концентрацию путем повторного использования всей массы либерализованного пептида в 60 микролитрах соответствующего растворителя. Соблюдайте раствор, чтобы убедиться, что пептид полностью растворен. Затем добавляют дополнительный объем растворителя по мере необходимости, чтобы сделать 12,5 миллимолярный раствор в соответствии с молекулярной массой, массой и чистотой пептидов.
В этом примере 5x пептидный запас имеет конечный объем 626,9 микролитров. Другие образцы пептидов потребуют другого конечного объема. Затем подготовьте 150 микролитров 1x пептидного раствора, добавьте 2,5 миллимолярную концентрацию, разбавляя 30 микролитров 5x пептидного запаса в 120 микролитра растворителя.
Вихрьте раствор в течение пяти секунд и центрифугируйте при комнатной температуре. Далее готовят 700 микролитров раствора 0,5 миллимолярного пептида BSA, разбавляя 140 микролитров 1x пептидного запаса в 560 микролитра 31,3% раствора BSA. После вихря центрифугируют раствор при комнатной температуре.
Аналогичным образом, готовят четыре последовательных 10-кратного последовательного разведения пептида BSA путем добавления 70 микролитров раствора пептида BSA к 630 микролитрам 25%-го раствора BSA. Чтобы приготовить пептидные гели BSA, добавьте 37% формальдегида в пептидные разведения BSA в соотношении один к одному, работая по одному образцу за раз. Хорошо перемешайте, пипетируя вверх и вниз пять раз в течение пяти-10 секунд без образования пузырьков воздуха.
После перемешивания поместите закрытую микроцентрифужную трубку в тепловой блок при температуре 85 градусов Цельсия на 10 минут. После того, как все растворы пептида BSA и формальдегида были приготовлены и нагреты, дайте гелям остыть на столешнице в течение пяти-10 минут. Затем, используя чистый, гибкий одноразовый лабораторный шпатель, извлеките образец геля из микроцентрифужной трубки одним куском.
И поместите его в герметичный контейнер, содержащий не менее 15 миллилитров нейтрального буферизованного формалина, используя отдельный контейнер для каждого образца. В качестве альтернативы, используя новое лезвие бритвы с одним лезвием, отрежьте дно трубки микроцентрифуги и вытолкните гель из нижней части воздухом или подходящим зондом. С помощью чистой однообрезной бритвы обрежьте гель-конус цилиндрическими дисками толщиной около пяти миллиметров.
После обертывания дисков в обертывание для биопсии поместите один большой гель-диск в одну кассету, а остальные гелевые диски вместе во вторую кассету для использования в конструкции тканевого микрочипа. Перед обработкой поместите кассетные гели по меньшей мере в 15 миллилитров 10% нейтрального буферизованного формалина на гель, используя отдельный контейнер для каждого образца. Затем обработайте гели в автоматизированном гистологическом тканевом процессоре, следуя большому тканевому графику с давлением и вакуумом.
Когда обработка образца будет завершена, извлеките кассеты из тканевого процессора и переместите их в центр встраивания парафина. После распаковки гелей из обертывания биопсии вставьте гели в парафин или каждый образец вставьте один диск геля в небольшую форму размером 15 на 15 миллиметров. А оставшиеся гелевые диски вместе во вторую большую форму.
Для каждой серии разбавления пептидов создайте два стеклянных слайда, содержащих в общей сложности шесть отдельных секций. Одна секция из каждого из пяти образцов серии разбавления и одна секция из только отрицательного контрольного образца BSA. После секционирования и сушки горок окрасьте два слайда, подготовленные для каждого пептида, желаемым первичным антителом.
Согласно стандартным протоколам иммуногистохимии ожидается увидеть относительно однородный сигнал в каждой секции геля. С различными образцами геля, показывающими диапазон интенсивности сигнала, соответствующий пептидным разбавлениям. Для построения микрочипа гелевой ткани BSA вырежьте участки микрочипа толщиной в четыре микрометра и окрасьте моноклональным антителом кролика в соответствии со стандартными лабораторными протоколами.
Оцените образовавшуюся интенсивность пятна качественно путем осмотра или количественно купите цифровое сканирование и анализ изображения. После реакции с соответствующими антителами отрицательный контроль BSA только образцов геля показал минимальный сигнал. Интенсивность сигнала в отдельном образце геля относительно равномерна и увеличивается с увеличением концентрации антигена.
Более 10% клеток MDA-MB-175 имеют слабое и полностью окружное мембранное окрашивание. Напротив, более 10% клеток SKBR-3 показывают интенсивное полностью окружное мембранное окрашивание Работайте быстро после добавления формальдегида, потому что растворы начнут гель даже при комнатной температуре. Мы используем этот метод для контроля IHC при тестировании новых антител, чтобы дать нам уверенность в том, что анализ выполнен так, как ожидалось, даже когда тестовые антитела не показывают сигнала.
Контроль тканей или клеточных линий по своей природе изменчив. Синтетический контроль антигенов позволяет более точно измерить эффект изменения конкретных условий реакции ISD.
