BSA 항원 겔은 기존 대조군을 보완할 수 있는 잘 특성화된 재현 가능한 IHC 표준물질입니다. 이 프로토콜은 표준 조직학 및 IHC 시약 및 방법을 사용하여 알려진 조성의 재현 가능한 표준을 만듭니다. 이러한 제어는 여러 실험실에서 진단적으로 관련된 많은 분석에 대해 IHC 분석을 교정하고 표준화할 수 있는 기회를 제공합니다.
펩티드 또는 단백질을 용해시키기에 적합한 용매를 찾는 것이 중요하다. 기포를 도입하지 않고 항원과 포름알데히드 용액을 빠르게 혼합하는 것은 까다로울 수 있습니다. 시작하려면 고르게 분포 될 때까지 50 밀리리터의 원추형 튜브에 14 밀리리터의 PBS에 5 그램의 BSA 분말을 혼합하여 25 중량 % BSA 용액 20 밀리리터를 준비하십시오.
용액을 와동시켜 BSA 분말을 용해시킨다. 완전히 용해되도록 용액을 섭씨 4도에서 밤새 보관하십시오. 다음날 PBS를 사용하여 최종 부피를 20 밀리리터로 조정하십시오.
유사하게, 13 밀리리터의 PBS에 6.26 그램의 BSA 분말을 혼합하여 31.3 중량% 중량% BSA 용액 20 밀리리터를 준비합니다. 완전한 용해를 위해 밤새 배양 한 후 PBS로 최종 부피를 20 밀리리터로 조정하십시오. BSA 포름알데히드 혼합물이 겔을 형성하는지 테스트하려면 열 블록을 섭씨 85도로 예열합니다.
그런 다음 700 마이크로 리터의 25 % BSA 용액과 700 마이크로 리터의 37 % 포름 알데히드를 혼합하십시오. 기포를 만들지 않고 5-10초 이내에 5회 위아래로 피펫팅하여 잘 섞습니다. 혼합 직후 닫힌 마이크로 원심 분리기 튜브를 섭씨 85도로 예열된 열 블록에 놓습니다.
10 분 후 열 블록에서 튜브를 제거하십시오. 식히고 젤이 예상대로 형성되었는지 확인하십시오. 8개의 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브를 준비하고 명확하게 라벨을 붙입니다.
이어서, 5x 펩티드 원액을 제조하고, 자유화된 펩티드의 전체 질량을 60 마이크로리터의 적절한 용매에 재현탁시켜 12.5 밀리몰 농도를 첨가한다. 펩타이드가 완전히 용해되었는지 확인하기 위해 용액을 관찰하십시오. 그런 다음 필요에 따라 용매를 추가하여 펩타이드 분자량, 질량 및 순도에 따라 12.5 밀리몰 용액을 만듭니다.
이 예에서, 5x 펩티드 스톡은 626.9 마이크로리터의 최종 부피를 갖는다. 다른 펩타이드 샘플은 다른 최종 부피를 필요로 할 것이다. 다음으로, 1x 펩티드 스톡 용액 150 마이크로리터를 준비하고, 5x 펩타이드 스톡 30 마이크로리터를 120 마이크로리터의 용매로 희석하여 2.5 밀리몰 농도를 첨가한다.
용액을 5 초 동안 와동시키고 실온에서 원심 분리합니다. 다음으로, 1x 펩타이드 스톡 140마이크로리터를 31.3%BSA 용액 560마이크로리터로 희석하여 0.5밀리몰 펩타이드 BSA 용액 700마이크로리터를 준비합니다. 볼텍싱 후 실온에서 용액을 원심분리합니다.
유사하게, 25% BSA 용액의 630 마이크로리터에 70 마이크로리터의 펩티드 BSA 용액을 첨가하여 펩티드 BSA 스톡의 4개의 연속 10x 연속 희석을 준비합니다. BSA 펩타이드 젤을 준비하려면 펩타이드 BSA 희석액에 37%포름알데히드를 한 번에 하나의 샘플씩 작동하는 1:1 비율로 첨가합니다. 기포를 만들지 않고 5-10초 이내에 5회 위아래로 피펫팅하여 잘 섞습니다.
혼합 후 닫힌 마이크로 원심 분리기 튜브를 섭씨 85 도의 열 블록에 10 분 동안 놓습니다. 모든 펩타이드 BSA와 포름알데히드 용액을 준비하고 가열한 후 겔을 벤치탑에서 5-10분 동안 식힙니다. 다음으로, 깨끗하고 유연한 일회용 실험실 주걱을 사용하여 마이크로 원심 분리기 튜브에서 겔 샘플을 한 조각으로 제거합니다.
적어도 15 밀리리터의 중성 완충 포르말린을 함유하는 밀봉 용기에 넣고, 각 샘플에 대해 별도의 용기를 사용한다. 또는 새로운 단일 모서리 면도날을 사용하여 마이크로 원심 분리기 튜브의 바닥을 잘라 내고 공기 또는 적절한 프로브로 바닥에서 젤을 밀어냅니다. 깨끗한 단일 날이 있는 면도기를 사용하여 겔 콘을 약 5mm 두께의 원통형 디스크로 자릅니다.
디스크를 생검 랩으로 감싼 후 하나의 큰 젤 디스크를 하나의 카세트에 넣고 나머지 젤 디스크를 함께 두 번째 카세트에 넣어 조직 마이크로 어레이 구성에 사용합니다. 처리하기 전에 각 샘플에 대해 별도의 용기를 사용하여 젤 당 최소 15 밀리리터의 10 % 중성 완충 포르말린에 카세트 젤을 넣으십시오. 다음으로, 자동화된 조직학 조직 프로세서에서 압력과 진공으로 큰 조직 일정에 따라 젤을 처리합니다.
샘플 처리가 완료되면 티슈 프로세서에서 카세트를 제거하고 파라핀 임베딩 센터로 옮깁니다. 생검 랩에서 젤을 개봉 한 후 젤을 파라핀에 삽입하거나 각 샘플에 젤 디스크 하나를 작은 15 x 15mm 몰드에 삽입합니다. 그리고 나머지 젤 디스크는 두 번째 더 큰 금형에서 함께 디스크됩니다.
각 펩타이드 희석 시리즈에 대해 총 6개의 개별 섹션을 포함하는 2개의 유리 슬라이드를 만듭니다. 5개의 희석 시리즈 샘플 각각으로부터의 하나의 섹션 및 BSA 전용 음성 대조군 샘플로부터의 하나의 섹션. 슬라이드를 절편하고 건조시킨 후, 각각의 펩티드에 대해 준비된 2개의 슬라이드를 원하는 1차 항체로 염색한다.
표준 면역 조직 화학 프로토콜에 따르면 각 겔 섹션 내에서 비교적 균일 한 신호를 볼 것으로 예상됩니다. 상이한 겔 샘플은 펩티드 희석물에 상응하는 신호 강도의 범위를 나타낸다. BSA 겔 조직 마이크로어레이 구축을 위해 조직 마이크로어레이의 4마이크로미터 두께 섹션을 절단하고 실험실 표준 프로토콜에 따라 토끼 단일클론 항체로 염색합니다.
검사를 통해 결과 얼룩 강도를 정성적으로 평가하거나 정량적으로 디지털 이미지 스캐닝 및 분석을 구입합니다. 적절한 항체와 반응한 후, 음성 대조군 BSA 겔 샘플만이 최소한의 신호를 보였다. 개별 겔 샘플의 신호 강도는 비교적 균일하며 항원 농도가 증가함에 따라 증가합니다.
MDA-MB-175 세포의 10 % 이상이 희미하고 완전히 원주 막 염색을 보입니다. 대조적으로, SKBR-3 세포의 10% 이상은 강렬한 완전 원주 막 염색을 보여줍니다 포름알데히드가 첨가되면 용액이 실온에서도 겔화되기 시작하기 때문에 빠르게 작동합니다. 우리는 이 방법을 사용하여 새로운 항체를 테스트할 때 IHC 대조군을 만들어 테스트 항체가 신호를 나타내지 않는 경우에도 분석이 예상대로 수행되었다는 확신을 줍니다.
조직 또는 세포주 제어는 본질적으로 가변적입니다. 합성 항원 제어를 통해 특정 ISD 반응 조건 변화의 효과를보다 정확하게 측정 할 수 있습니다.
