Os géis de antígeno BSA são padrões de IHC reprodutíveis bem caracterizados que podem complementar os controles existentes. Este protocolo usa histologia padrão e reagentes IHC e métodos para fazer padrões reprodutíveis de composição conhecida. Esses controles oferecem a oportunidade para diferentes laboratórios calibrarem e padronizarem ensaios de IHC para muitos ensaios diagnosticamente relevantes.
É importante encontrar um solvente adequado para dissolver o peptídeo ou proteína. Pode ser complicado misturar soluções de antígeno e formaldeído rapidamente sem introduzir bolhas. Para começar, prepare 20 mililitros de uma solução BSA de 25% de peso em volume, misturando cinco gramas de pó BSA em 14 mililitros de PBS, em um tubo cônico de 50 mililitros até distribuído uniformemente.
Vórtice a solução para dissolver o pó BSA. Mantenha a solução durante a noite a quatro graus Celsius para dissolução completa. No dia seguinte, ajuste o volume final para 20 mililitros com PBS.
Da mesma forma, prepare 20 mililitros de um peso de 31,3% em volume de solução BSA misturando 6,26 gramas de pó BSA em 13 mililitros de PBS. Após a incubação durante a noite para dissolução completa, ajuste o volume final para 20 mililitros com PBS. Para testar que a mistura de formaldeído BSA forma um gel, pré-aqueça um bloco de calor a 85 graus Celsius.
Em seguida, misture 700 microliters da solução 25% BSA com 700 microliters de 37%. Misture bem ao subir e descer cinco vezes dentro de cinco a dez segundos sem criar bolhas de ar. Imediatamente após a mistura, coloque o tubo de micro centrífuga fechado no bloco de calor pré-aquecido a 85 graus Celsius.
Após 10 minutos, retire o tubo do bloco de calor. Deixe esfriar e confirme se o gel se formou como esperado. Prepare e rotule claramente oito tubos de micro centrífugas de 1,5 mililitro.
Em seguida, prepare uma solução de estoque de peptídeo de 5x, adicione uma concentração de 12,5 mililitros, reutilizando toda a massa do peptídeo liberalizado em 60 microliters do solvente apropriado. Observe a solução para garantir que o peptídeo seja completamente dissolvido. Em seguida, adicione um volume adicional de solvente conforme necessário para fazer uma solução de 12,5 milimões de acordo com os peptídeos peso molecular, massa e pureza.
Neste exemplo, o estoque de peptídeos 5x tem um volume final de 626,9 microliters. Outras amostras de peptídeos exigirão um volume final diferente. Em seguida, prepare 150 microliters de uma solução de estoque de peptídeo de 1x adicione uma concentração de 2,5 mililitros diluindo 30 microliters do estoque de peptídeos de 5x em 120 microlitres do solvente.
Vórtice a solução por cinco segundos e centrífuga à temperatura ambiente. Em seguida, prepare 700 microliters de uma solução BSA de peptídeo de 0,5 mililitro, diluindo 140 microliters do estoque de peptídeos 1x em 560 microliters da solução BSA de 31,3%. Após o vórtice, centrifufique a solução à temperatura ambiente.
Da mesma forma, prepare quatro diluições seriais sucessivas de 10x do estoque bsa peptídeo adicionando 70 microliters da solução peptídeo BSA a 630 microliters da solução 25% BSA. Para preparar os géis de peptídeo bsa, adicione 37% de formaldeído às diluições de peptídeos BSA em uma razão de um para um trabalhando uma amostra de cada vez. Misture bem ao subir e descer cinco vezes dentro de cinco a dez segundos sem criar bolhas de ar.
Após a mistura, coloque o tubo de micro centrífuga fechado em um bloco de calor a 85 graus Celsius por 10 minutos. Depois de todas as soluções de peptídeo BSA e formaldeído terem sido preparadas e aquecidas, permita que os géis esfriem no banco por cinco a 10 minutos. Em seguida, usando uma espátula de laboratório descartável limpa e flexível, remova a amostra de gel do tubo de micro centrífuga em uma peça.
E coloque-o em um recipiente selado contendo pelo menos 15 mililitros de formalina tamponada neutra, usando um recipiente separado para cada amostra. Alternativamente, usando uma nova lâmina de barbear de borda única, corte a parte inferior do tubo de micro centrífuga e empurre o gel para fora da parte inferior com ar ou uma sonda adequada. Usando uma lâmina de barbear de borda única limpa aparar o cone de gel em discos cilíndricos com aproximadamente cinco milímetros de espessura.
Depois de embrulhar os discos em um envoltório de biópsia, coloque um disco de gel maior em um e os discos de gel restantes juntos em um segundo para uso na construção de microarray tecidual. Antes do processamento, coloque os géis em pelo menos 15 mililitros de formalina tamponada 10% neutra por gel, usando um recipiente separado para cada amostra. Em seguida, processe os géis em um processador automatizado de tecido histologia seguindo um grande cronograma de tecido com pressão e vácuo.
Quando o processamento da amostra estiver concluído, remova as fitas do processador de tecido e mova-as para o centro de incorporação da parafina. Depois de desembrulhar os géis do envoltório da biópsia, incorpore os géis em parafina ou cada amostra incorpore um disco de gel em um pequeno molde de 15 por 15 milímetros. E os discos de gel restantes juntos em um segundo molde maior.
Para cada série de diluição de peptídeos, crie dois slides de vidro contendo um total de seis seções separadas. Uma seção de cada uma das cinco amostras da série de diluição e uma seção da BSA apenas amostra de controle negativo. Após a secção e secagem dos slides, manche os dois slides preparados para cada peptídeo com o anticorpo primário desejado.
De acordo com os protocolos padrão de imunohistoquímica esperam ver um sinal relativamente uniforme dentro de cada seção de gel. Com as diferentes amostras de gel mostrando uma gama de intensidade de sinal correspondente às diluições do peptídeo. Para a construção de microarray de tecido gel BSA, corte quatro seções de micrometro de espessura da microarray tecidual e colorisse com um anticorpo monoclonal de coelho de acordo com protocolos padrão laboratorial.
Avalie a intensidade da mancha resultante qualitativamente por inspeção ou compre quantitativamente digitalização e análise de imagens. Após reagir com os anticorpos apropriados, o controle negativo BSA apenas amostras de gel mostrou sinal mínimo. A intensidade do sinal em uma amostra de gel individual é relativamente uniforme e aumenta com o aumento das concentrações de antígeno.
Mais de 10% das células MDA-MB-175 apresentam leve e em coloração membranous completamente circunferencial. Em contraste, mais de 10% das células SKBR-3, mostram uma mancha membranous completamente circunferencial intensa Trabalhe rapidamente uma vez que o formaldeído tenha sido adicionado porque as soluções começarão a gelar mesmo à temperatura ambiente. Usamos este método para fazer controles de IHC ao testar novos anticorpos para nos dar confiança de que o ensaio realizado como esperado, mesmo quando os anticorpos de teste não mostram nenhum sinal.
Os controles de tecido ou linha celular são inerentemente variáveis. Os controles de antígeno sintético permitem medir o efeito da mudança das condições específicas de reação do ISD com mais precisão.
