Los geles de antígenos BSA son estándares IHC reproducibles bien caracterizados que pueden complementar los controles existentes. Este protocolo utiliza histología estándar y reactivos y métodos de IHQ para hacer estándares reproducibles de composición conocida. Estos controles brindan la oportunidad a diferentes laboratorios de calibrar y estandarizar los ensayos IHQ para muchos ensayos relevantes para el diagnóstico.
Es importante encontrar un disolvente adecuado para disolver el péptido o proteína. Puede ser difícil mezclar soluciones de antígeno y formaldehído rápidamente sin introducir burbujas. Para comenzar, prepare 20 mililitros de una solución de BSA de 25% de peso por volumen mezclando cinco gramos de polvo de BSA en 14 mililitros de PBS, en un tubo cónico de 50 mililitros hasta que se distribuya uniformemente.
Vortex la solución para disolver el polvo BSA. Mantenga la solución durante la noche a cuatro grados centígrados para una disolución completa. Al día siguiente, ajuste el volumen final a 20 mililitros con PBS.
Del mismo modo, prepare 20 mililitros de una solución de BSA de 31.3% de peso por volumen mezclando 6.26 gramos de polvo de BSA en 13 mililitros de PBS. Después de la incubación nocturna para una disolución completa, ajuste el volumen final a 20 mililitros con PBS. Para probar que la mezcla de formaldehído BSA forma un gel, precaliente un bloque de calor a 85 grados centígrados.
Luego mezcle 700 microlitros de la solución BSA al 25% con 700 microlitros de formaldehído al 37%. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo cinco veces en cinco a 10 segundos sin crear burbujas de aire. Inmediatamente después de mezclar, coloque el tubo de microcentrífuga cerrado en el bloque de calor precalentado a 85 grados centígrados.
Después de 10 minutos, retire el tubo del bloque de calor. Deje que se enfríe y confirme que el gel se ha formado como se esperaba. Prepare y etiquete claramente ocho tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Luego prepare una solución madre de péptidos 5x, agregue una concentración de 12.5 milimolar resuspendiendo toda la masa del péptido liberalizado en 60 microlitros del solvente apropiado. Observe la solución para asegurarse de que el péptido esté completamente disuelto. Luego agregue un volumen adicional de solvente según sea necesario para hacer una solución milimolar de 12.5 de acuerdo con el peso, la masa y la pureza molecular de los péptidos.
En este ejemplo, el stock de péptidos 5x tiene un volumen final de 626.9 microlitros. Otras muestras de péptidos requerirán un volumen final diferente. A continuación, prepare 150 microlitros de una solución madre de péptidos 1x y agregue una concentración de 2.5 milimolar diluyendo 30 microlitros del stock de péptidos 5x en 120 microlitros del solvente.
Vortex la solución durante cinco segundos y centrifugar a temperatura ambiente. A continuación, prepare 700 microlitros de una solución BSA de péptido 0,5 milimolar diluyendo 140 microlitros del stock de péptidos 1x en 560 microlitros de la solución BSA al 31,3%. Después del vórtice, centrifugar la solución a temperatura ambiente.
Del mismo modo, prepare cuatro diluciones seriadas sucesivas 10x del cepto BSA agregando 70 microlitros de la solución de péptido BSA a 630 microlitros de la solución BSA al 25%. Para preparar los geles peptídicos BSA, agregue formaldehído al 37% a las diluciones de péptidos BSA en una proporción de uno a uno trabajando una muestra a la vez. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo cinco veces en cinco a 10 segundos sin crear burbujas de aire.
Después de mezclar, coloque el tubo de microcentrífuga cerrado en un bloque de calor a 85 grados centígrados durante 10 minutos. Después de que todas las soluciones de péptidos BSA y formaldehído se hayan preparado y calentado, deje que los geles se enfríen en la mesa de trabajo durante cinco a 10 minutos. A continuación, utilizando una espátula de laboratorio desechable limpia y flexible, retire la muestra de gel del tubo de microcentrífuga en una sola pieza.
Y colóquelo en un recipiente sellado que contenga al menos 15 mililitros de formalina tamponada neutra, utilizando un recipiente separado para cada muestra. Alternativamente, usando una nueva cuchilla de afeitar de un solo filo, corte la parte inferior del tubo de microcentrífuga y empuje el gel desde la parte inferior con aire o una sonda adecuada. Usando una maquinilla de afeitar limpia de un solo borde, recorte el cono de gel en discos cilíndricos de aproximadamente cinco milímetros de espesor.
Después de envolver los discos en una envoltura de biopsia, coloque un disco de gel más grande en un casete y los discos de gel restantes juntos en un segundo casete para su uso en la construcción de microarrays de tejido. Antes del procesamiento, coloque los geles de casete en al menos 15 mililitros de formalina tamponada neutra al 10% por gel, utilizando un recipiente separado para cada muestra. A continuación, procese los geles en un procesador de tejido histológico automatizado siguiendo un programa de tejido grande con presión y vacío.
Cuando se complete el procesamiento de la muestra, retire los casetes del procesador de tejidos y muévalos al centro de incrustación de parafina. Después de desenvolver los geles de la envoltura de biopsia, incruste los geles en parafina o cada muestra inserte un disco de gel en un molde pequeño de 15 por 15 milímetros. Y los discos de gel restantes se unen en un segundo molde más grande.
Para cada serie de dilución peptídica, cree dos portaobjetos de vidrio que contengan un total de seis secciones separadas. Una sección de cada una de las cinco muestras de la serie de dilución y una sección de la muestra de control negativo de BSA solamente. Después de seccionar y secar los portaobjetos, tiñe los dos portaobjetos preparados para cada péptido con el anticuerpo primario deseado.
De acuerdo con los protocolos estándar de inmunohistoquímica, espere ver una señal relativamente uniforme dentro de cada sección de gel. Con las diferentes muestras de gel mostrando un rango de intensidad de señal correspondiente a las diluciones peptídicas. Para la construcción de microarrays de tejido de gel BSA, corte secciones de cuatro micrómetros de espesor del microarray de tejido y tiñe con un anticuerpo monoclonal de conejo de acuerdo con los protocolos estándar de laboratorio.
Evalúe cualitativamente la intensidad de la mancha resultante mediante inspección o compre cuantitativamente escaneo y análisis de imágenes digitales. Después de reaccionar con los anticuerpos apropiados, las muestras de gel de control negativo de BSA solo mostraron una señal mínima. La intensidad de la señal en una muestra de gel individual es relativamente uniforme y aumenta con el aumento de las concentraciones de antígenos.
Más del 10% de las células MDA-MB-175 muestran tinción membranosa débil y completamente circunferencial. En contraste, más del 10% de las células SKBR-3, muestran una intensa tinción membranosa completamente circunferencial Trabajar rápidamente una vez que se ha agregado el formaldehído porque las soluciones comenzarán a gelificarse incluso a temperatura ambiente. Utilizamos este método para realizar controles de IHQ cuando se prueban nuevos anticuerpos para darnos la confianza de que el ensayo funcionó como se esperaba, incluso cuando los anticuerpos de prueba no muestran ninguna señal.
Los controles de tejidos o líneas celulares son inherentemente variables. Los controles de antígenos sintéticos nos permiten medir el efecto de cambiar las condiciones específicas de reacción ISD con mayor precisión.
