肝細胞癌における腫瘍間質相互作用を調べる三次元スフェロイドモデル

3D腫瘍スフェロイドは、インビトロがん研究のゴールドスタンダードとして従来の2D単層技術に取って代わりました。これらのモデルは、腫瘍微小環境の不均一性を反映し、空間相互作用の活用を可能にする複数の細胞タイプの共培養を可能にする。3Dスフェロイドを生成するために吊り下げ液滴法を使用することの利点は、細胞とプラスチックの相互作用の欠如と腫瘍細胞と非腫瘍細胞との相互作用を研究する容易さである。

この技術はまた、腫瘍間質相互作用をモデル化する再現性と費用対効果の高い方法を提供します。3D腫瘍性腫瘍は、貴重な前臨床モデルであり、しばしば薬物スクリーニングツールとして使用されます。この方法は、腫瘍増殖および周囲の微小環境に対する複数の化合物の薬理学的効果を研究するために適用することができる。

スフェロイド形成のプロセスはユーザーフレンドリーであり、従来の細胞培養ラボ装置を必要とします。回転楕円体は、任意のベンチトップ反転光顕微鏡を使用して画像化することができ、広く利用可能なオンライン画像解析ソフトウェアを使用して、スフェロイドのサイズと形状の解析を行うことができます。まず、フー7とHep3B HCC腫瘍細胞株とCOS-7およびLX2線維芽細胞株を液体窒素中の貯蔵ラックから取り出し、急速に解凍します。

解凍後、解凍した細胞を2ミリリットルの新鮮な培養培地で希釈します。細胞を遠心分離します。上清を捨て、新鮮な温かい培養培地の1ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁する。

次に、T75細胞培養フラスコに細胞を播種し、細胞が60〜70&合流するまで細胞培養インキュベーターにインキュベートします。細胞採取のために、培養培地を吸引し、PBSで細胞を3回洗浄する。その後、フラスコの底から付着細胞を取り外し、2ミリリットルの予め温めたトリプシンを加え、摂氏37度でインキュベートします。

4分後、完全な培養培地を4ミリリットル添加してトリプシンを不活性化し、細胞懸濁液を回収し、その後、細胞を遠心分離し、上清を捨ててから、新鮮な培養培地の1ミリリットルで細胞を再懸濁する。最後に、新鮮な培養培地を3ミリリットル追加します。細胞を数えるために、細胞懸濁液を穏やかに渦液する。

その後、10マイクロリットルのピペットを使用し、10マイクロリットルのトリパンブルーとセルサスペンションを混合し、混合物を上下に4回穏やかにピペットして、外細胞表面の完全な染色を確実にします。次に、ヘモサイトメーター計の計数面積の上にカバースリップを置きます。次に、セル混合物を含むピペットチップをカバースリップの端の隣に置き、チップ含有量をカウントスライドに静かに排出します。

スラリーが沈着するまで数分待った後、顕微鏡ステージでヘモサイトメーターを固定し、下または左の判決を重ね合わしたものを避けながら、上または右の支配を重ね合わされた細胞を数えます。最後に、この数式を使用してセルの合計数を計算します。培養液を吸引した後、LX2細胞をPBSで3回洗浄する。

先に示したようにトリプシンを使用して細胞を取り外し、遠心分離します。先に示したように細胞を数えた後、10立方センチメートルの皿の6番目のLX2細胞に10回種を入れ、摂氏37度でインキュベートする。48時間後、繊維芽細胞調整培地及び遠心分離機を集めて、任意の浮遊細胞をペレットにする。

フィルターは、20ミリリットルシリンジに取り付けられた0.22ミクロンフィルターを使用して、コンディショナー培地を殺菌します。その後、マイナス80°Cで貯蔵するための2ミリリットルのチューブにメディアをアリクォート。10立方センチメートル皿の底に10ミリリットルの無菌PBSを加えて、スフェロイドに湿度の高い条件を提供します。

次いで、1,500 HuH7 HCC細胞を吊り下げ、1,500個のCOS-7哺乳動物線維芽細胞を吊り下げ液滴で細胞球を形成する。皿のふたを反転させて、細胞懸濁液を含むメディアが湿気の多い環境にかかわるのを可能にする。3日後、回転楕円体の画像を撮るために、逆顕微鏡のステージに皿を置き、倍率を5倍に調整します。

次に、取り付けたコンピュータで顕微鏡ソフトウエアを開き、焦点を合わせて、すべての回転楕円体の鮮明な画像を持つ。次に、画像を取得し、取得した画像を保存するために顕微鏡ソフトウェア上のスナップツールを使用しています。10立方センチメートル皿の底に10ミリリットルの無菌PBSを加えます。

その後、吊り下げ液滴に3,000 Hep3B HCC細胞を懸濁させて球体を形成し、皿の蓋を反転させ、液滴が湿度の高い環境に3日間ぶら下がるようにします。次に、ヘプ3Bスフェロイドを、吊り下げ液滴のLX2細胞から20マイクロリットルの新鮮な状態培地に移す。次に、回転楕円体が形成された皿の蓋を反転し、光顕微鏡のステージに蓋を固定します。

顕微鏡の細かい焦点を調整して、前に示したように各回転楕円体を見えるようにします。プランジャーボタンを押してマイクロピペットから空気を慎重に空にした後、移すスフェロイドを含む液滴にピペットチップを挿入します。先端で触れることなく、スフェロイドに非常に近づく。

次に、プランジャーボタンの圧力を静かに放出し、2マイクロリットルの媒体でスフェロイドをマイクロピペット先端に吸引できるようにします。その後、新しい10立方センチメートルの皿にぶら下がっている新しい液滴に回転楕円体を転送します。LX2コンディショネな培地で転写された顕微鏡を用いて5倍の倍率でスフェロイドの画像を撮影します。

成長する回転楕円体の画像を解析するには、画像解析ソフトウェアで各回転楕円体画像を開き、フリーハンド選択ツールを使用して各回転楕円体の輪郭を描きます。次に、解析ドロップダウンボタンから、設定測定を選択し、続いて面積を選択して[OK]を押します。次に、各回転楕円の周囲に手動で円を描き、球が丸にくらんだら、Control M を押して、プログラムがピクセル単位で回転楕円体領域を計算できるようにします。次に、この式を使用して、回転楕円体の面積を体積に変換します。

最後に、イメージキャプチャの初日の体積に対する回転数の変化を計算します。スフェロイド形成のための細胞密度の最適化中に、12,000および6の高い播種密度は、000細胞が非対称形状のスフェロイドを生み出し、3,000細胞の播種密度は完全に丸められた3D回転楕円体を与えた。したがって、3,000個の細胞密度スフェロイドがさらなる実験に適応した。

共培養腫瘍と線維芽細胞株からの増殖性影響の縦断評価は、4日目以降、異質球形がホモタイプスフェロイドと比較して理想的な丸状の形で成長したことを示した。ヘテロチピックスフェロイドは当初、4日目から7日目まで急速な成長段階を示し、その後8日目には遅い段階が続いた。その後、スフェロイド量は9日目と10日目に減少し、栄養素の枯渇や低酸素コアおよび細胞死を反映している可能性がある。

対照的に、ホモタイピックスフェロイドは5日目まで比較的静的な成長曲線を示し、その後6日目以降の成長曲線の徐々な増加を示した。ヘテロチピックスフェロイドの高い成長速度は、腫瘍と線維芽細胞の間の直接接触が腫瘍スフェロイドのサイズを増加することを示唆している。3日齢のホモタイプHep3Bスフェロイドが新鮮な培地で成長した場合、細胞は3日後に完全に丸みを帯びたスフェロイドを形成し、7日目まで増殖を続けることを示した。

LX2コンディショネド培地でスフェロイドを維持した場合の増殖速度が増強され、腫瘍スフェロイドの線維芽細胞駆動増殖を示唆した。スフェロイド形成に適した湿度の高い状態を維持するために、皿の底に滅菌BBSを確実に加える必要があります。また、蓋を逆にして、回転楕円体や液滴が乱れないように注意してください。

3D腫瘍スフェロイドは、免疫化学や免疫蛍光などの将来の用途のために固定または凍結保存することができ、また、トランスクリプトミック分析のためのRNA抽出も可能です。細胞に予め標識されたヘテロチピックスフェロイドを画像化し、追跡して、腫瘍微小環境内の細胞間相互作用に関する洞察を提供することができる。