Gli sferoidi tumorali 3D hanno sostituito la tradizionale tecnica 2D monostrato come gold standard per la ricerca sul cancro in vitro. Questi modelli consentono la co-coltura di più tipi di cellule che riflettono l'eterogeneità del microambiente tumorale e consentono lo sfruttamento delle interazioni spaziali. I vantaggi dell'utilizzo del metodo delle goccioline sospese per generare sferoidi 3D sono la mancanza di interazione cellula-plastica e la facilità di studiare l'interazione tra le cellule tumorali e le cellule non tumorali.
Questa tecnica fornisce anche un modo riproducibile ed economico per modellare l'interazione tumore-stromale. I tumoroidi 3D sono preziosi modelli preclinici e sono spesso usati come strumento di screening farmacologico. Questo metodo può essere applicato per studiare gli effetti farmacologici di più composti sulla crescita tumorale e sul microambiente circostante.
Il processo di formazione degli sferoidi è facile da usare e richiede attrezzature di laboratorio di coltura cellulare convenzionali. Gli sferoidi possono essere ripresi utilizzando qualsiasi microscopio a luce invertita da banco e l'analisi delle dimensioni e della forma dello sferoide può essere eseguita utilizzando un software di analisi delle immagini online ampiamente disponibile. Per iniziare, rimuovere le linee cellulari tumorali HCC Huh7 e Hep3B e le linee cellulari dei fibroblasti COS-7 e LX2 dal loro rack di stoccaggio in azoto liquido e scongelarle rapidamente.
Dopo lo scongelamento, diluire le cellule scongelate con due millilitri di terreno di coltura fresco. Centrifugare le cellule. Scartare il surnatante e risospescere il pellet cellulare in un millilitro di terreno di coltura caldo fresco.
Quindi seminare le cellule in palloni di coltura cellulare T75 e incubarle in un incubatore di colture cellulari fino a quando le cellule raggiungono da 60 a 70 e confluenza. Per la raccolta cellulare, aspirare il terreno di coltura e lavare le cellule tre volte con PBS. Quindi, per staccare le cellule aderenti dal fondo dei palloni, aggiungere due millilitri di tripsina preriscaldata e incubare a 37 gradi Celsius.
Dopo quattro minuti, inattivare la tripsina aggiungendo quattro millilitri di terreno di coltura completo e raccogliere la sospensione cellulare, quindi centrifugare le cellule ed eliminare il surnatante prima di risospendere le cellule in un millilitro di terreno di coltura fresco. Infine, aggiungere altri tre millilitri di terreno di coltura fresco. Per contare le cellule, ruotare delicatamente la sospensione cellulare.
Quindi utilizzando una pipetta da 10 microlitri, mescolare 10 microlitri della sospensione cellulare con 10 microlitri di tripano blu e pipettare delicatamente la miscela su e giù quattro volte per garantire la completa colorazione della superficie cellulare esterna con il colorante. Quindi, posizionare una coverslip sopra l'area di conteggio dell'emocitometro. Quindi posizionare la punta della pipetta contenente la miscela di cellule accanto al bordo del coperchio ed espellere delicatamente il contenuto della punta nella diapositiva di conteggio.
Dopo aver atteso qualche minuto che il liquame si depositi, fissare l'emocitometro sullo stadio del microscopio e contare le cellule che si sovrappongono alla riga superiore o destra evitando quelle che si sovrappongono alla regolazione inferiore o sinistra. Infine, calcola il numero totale di celle usando questa formula. Dopo aver aspirato il terreno di coltura, lavare le cellule LX2 tre volte con PBS.
Staccare le cellule usando la tripsina come dimostrato in precedenza e centrifugarle. Dopo aver contato le cellule come dimostrato in precedenza, seminare una volta 10 alla sesta cella LX2 in piatti da 10 centimetri cubici e incubare a 37 gradi Celsius. Dopo 48 ore, raccogliere il mezzo condizionato dai fibroblasti e centrifugare per pellettizzare eventuali cellule galleggianti.
Il filtro sterilizza il mezzo condizionato utilizzando un filtro da 0,22 micron collegato a una siringa da 20 millilitri. Quindi aliquotare il fluido in due tubi millilitri per la conservazione a meno 80 gradi Celsius. Aggiungere 10 millilitri di PBS sterile sul fondo di un piatto da 10 centimetri cubici per fornire condizioni umide per gli sferoidi.
Quindi sospendere 1.500 cellule HCC HuH7 con 1.500 cellule di fibroblasti di mammiferi COS-7 in goccioline appese per formare sfere. Capovolgere il coperchio del piatto per consentire al supporto, compresa la sospensione cellulare, di appendere su un ambiente umido. Dopo tre giorni, per scattare immagini degli sferoidi, metti il piatto sul palco di un microscopio invertito e regola l'ingrandimento a cinque volte.
Quindi, aprire il software del microscopio sul computer collegato e regolare la messa a fuoco per avere un'immagine chiara di ogni sferoide. Quindi utilizzare lo strumento snap sul software del microscopio per acquisire le immagini e salvare le immagini acquisite. Aggiungere 10 millilitri di PBS sterile sul fondo di un piatto di 10 centimetri cubici.
Quindi sospendere 3.000 cellule HCC Hep3B nelle goccioline appese per formare sfere e invertire il coperchio del piatto permettendo alle goccioline di appendere su un ambiente umido per tre giorni. Quindi, trasferire gli sferoidi Hep3B in 20 microlitri di mezzi di condizione freschi da cellule LX2 in goccioline sospese. Quindi capovolgere il coperchio del piatto su cui si formano gli sferoidi e fissare il coperchio sul palco di un microscopio ottico.
Regolare la messa a fuoco fine del microscopio per rendere visibile ogni sferoide come dimostrato in precedenza. Dopo aver premuto il pulsante dello stantuffo per svuotare accuratamente l'aria dalla micropipetta, inserire la punta della pipetta nella goccia contenente lo sferoide da trasferire. Avvicinati molto allo sferoide senza toccarlo con la punta.
Quindi, rilasciare delicatamente la pressione sul pulsante dello stantuffo per consentire l'aspirazione dello sferoide nella punta della micropipetta in due microlitri di media. Quindi trasferire lo sferoide in una nuova goccia appesa a un nuovo piatto di 10 centimetri cubici. Scatta immagini degli sferoidi a cinque volte l'ingrandimento usando un microscopio invertito dal giorno del trasferimento fino al settimo giorno di coltura nel supporto condizionato LX2.
Per analizzare le immagini degli sferoidi in crescita, aprire ogni immagine sferoide in un software di analisi delle immagini e utilizzare lo strumento di selezione a mano libera per delineare ogni sferoide. Quindi, dal pulsante a discesa dell'analisi, selezionare Imposta misurazione, quindi Area e premere OK. Quindi, disegna manualmente un cerchio attorno a ciascun sferoide e una volta che la sfera è cerchiata, premi Ctrl M per consentire al programma di calcolare l'area sferoide in pixel. Quindi convertire l'area dello sferoide in un volume utilizzando questa formula.
Infine, calcola la variazione del volume sferoide rispetto al suo volume il primo giorno di acquisizione dell'immagine. Durante l'ottimizzazione della densità cellulare per la formazione di sferoidi, densità di semina più elevate di 12.000 e 6.000 cellule hanno prodotto sferoidi con una forma asimmetrica, mentre una densità di semina di 3.000 cellule ha dato un perfetto sferoide 3D arrotondato. Pertanto, 3.000 sferoidi a densità cellulare sono stati adattati per ulteriori esperimenti.
La valutazione longitudinale dell'impatto proliferativo delle linee cellulari tumorali e fibroblasti co-coltivatrici ha mostrato che dal quarto giorno in poi, gli sferoidi eterotipici sono cresciuti in una forma rotonda ideale rispetto agli sferoidi omotipici. Gli sferoidi eterotipici hanno inizialmente mostrato una rapida fase di crescita a partire dal quarto al settimo giorno, seguita da una fase più lenta all'ottavo giorno. Il volume sferoide è poi diminuito nei giorni nove e 10, probabilmente riflettendo l'esaurimento dei nutrienti o un nucleo ipossico e la morte cellulare.
Al contrario, gli sferoidi omotipici hanno mostrato una curva di crescita relativamente statica fino al quinto giorno, seguita da un graduale aumento delle loro curve di crescita dal sesto giorno in poi. Il più alto tasso di crescita degli sferoidi eterotipici suggerisce che il contatto diretto tra tumore e fibroblasti aumenta le dimensioni degli sferoidi tumorali. Quando gli sferoidi omotipici Hep3B di tre giorni sono stati coltivati in terreni freschi, le cellule hanno formato sferoidi perfettamente arrotondati dopo tre giorni e hanno mostrato una proliferazione continua fino al settimo giorno.
Il tasso di crescita è stato migliorato quando gli sferoidi sono stati mantenuti in terreni condizionati LX2, suggerendo una proliferazione guidata dai fibroblasti degli sferoidi tumorali. È fondamentale assicurarsi che il BBS sterile venga aggiunto sul fondo dei piatti per mantenere condizioni umide adeguate per la formazione di sferoidi. Inoltre, fai attenzione mentre inverti il coperchio in modo che gli sferoidi e le goccioline non vengano interrotti.
Gli sferoidi tumorali 3D possono essere fissati o congelati e conservati per applicazioni future come l'immunochimica o l'immunofluorescenza, nonché l'estrazione dell'RNA per l'analisi trascrittomica. Gli sferoidi eterotipici con cellule pre-marcate possono essere ripresi e tracciati per fornire informazioni sulle interazioni cellula-cellula all'interno del microambiente tumorale.
