この手順は非常に敏感であり、最小限の背景を持ついくつかのトランスクリプトの可視化を可能にする。この方法は、非常に異種細胞型の転写プロファイルの正確な地図を生成することができる。この手順を実証することは、私と研究室の研究技術者であるジョンソン・ボブ・マヌエルです。
解剖スコープと手術器具の助けを借りて、8週齢のマウスから8週間前のマウスから全迷走神経節塊を収集することから始めます。マウスの切断後、小さな鉗子を使用して、後頭部の骨を露出させるために、気管に向けてステノヒロイドおよびオモヨイド筋肉を取り除く。頸動脈、迷走および低光沢神経および前門のマグナムが見えるまで、筋肉および組織の領域全体をクリアする。
その後、小さな春のはさみで低光沢神経全体をカットします。口腔マグナムに近い半透明の塊として、無用量ガングリオンを見つけます。小さいはさみを使って、後頭部骨を慎重に折る。
さらに、頸神経節を露出するには、視覚的なランドマークとして、頸部の表面に黒いメラノサイトを見つけます。神経節が見つかったら、迷走神経節系の間の神経の付着を切断し、迷走神経の末端を優しく引っ張りながら、神経節系質量全体の抽出のために小さなスプリングハサミで脳幹に向かって頸神経節を切断する。結合組織、神経節性質量および迷走神経に付着した脂肪を除去する。
迷走神経の約半分のセンチメートルを維持し、サンプルの取り扱いと局在化を容易にします。1.5ミリメートルマイクロ遠心管の細かい鉗子の助けを借りて神経節に除去を置きます。そして、24時間ホルマリンで摂氏4度でインキュベートします。
そして、24時間30%スクロースで。インキュベーション後、アルミホイルの上に最適な切削温度媒体の4ミリメートル直径のドロップ内に神経節を配置します。そして、ドライアイスのベッドの上にサンプルをフレーズ。
凍結したサンプルを凍結したサンプルを氷像で14マイクロメートルの厚さのセクションにマイナス20°Cで切り、ガラス顕微鏡スライド上の切片を42マイクロメートル離れたところに集めます。PBSの組織切片でスライドをすすいでください。そして、ベーキングオーブンで摂氏60度で30分間焼きます。
その後、4%ホルマリンにスライドを4°Cで15分間後置きします。スライドを50%70%、100%エタノールでそれぞれ5分間連続脱水します。そして、二重蒸留水ですする前に10分間、試料に過酸化水素溶液を塗布する。
in situハイブリダイゼーション(ISH)では、サンプルを対象の回収試薬で5分間処理します。その後、サンプルを二重蒸留水と100%エタノールで連続して水乾燥させます。疎水性ペンを使用して、サンプルの周囲にバリアを作成します。
サンプルは摂氏40度で30分間プロテアーゼとハイブリダイゼーションオーブンで処理されている間、プローブを摂氏40度で予熱し、使用前に室温で冷却します。オーブンから移動した後、ハイブリダイゼーションオーブンで摂氏40度で2時間、目的のプローブの所望の組み合わせでスライドをインキュベートします。ジヒドロジピコリン酸還元法またはDapBを用いて陰性対照組織をインキュベートし、摂氏40度で2時間標的C1プローブを用いた。
スライドを洗浄バッファーで洗い流し、室温でクエン酸ナトリウムを一晩5倍に保存します。翌日、増幅試薬でインキュベーションする前に、洗浄バッファーでスライドを洗い流します。そして、原稿に記載されているようにチャネル特異的試薬で治療する。
スライドを洗い、DapBで30秒間洗います。次に、各スライドに取り付け媒体をすぐに塗布し、カバースリップを組織セクションの上に置きます。画像が撮れるまで、スライドホルダの組織を4°Cに水平に保ちます。
必要なパラメータを設定して、画像化のための共焦点顕微鏡を準備します。画像の品質を向上させるために、4のライン平均と1024 x 1024以上のピクセルサイズで画像を取得します。取得パラメータに満足したら、同じ設定を使用して画像の取得を開始します。
各チャネルに誤った色を設定して、視覚化を容易にします。デジタル画像を用いて、DapBで軽く染色された1つの核を有するRNAスコープ陽性プロファイルの輪郭を同定して細胞カウントを行う。各転写物を発現するRNAスコープ陽性プロファイルの割合を計算します。
最適な集録パラメータは、陰性対照組織で得られた非特異的蛍光に基づいて、各レーザーに対して選択された。若年成人マウスの無用量神経節における内因性蛍光は最小限である。DapBプローブを用いたインキュベーションとは、シグナルをもたらさなかった。
488ナノメートルレーザーで増加したパワーレーザーとゲインで、不要な背景とランダムな蛍光ドットが表示されます。RNAスコープ技術は、迷走神経節塊の組織切片における3つの遺伝子を検出するために適用された。組織プロファイルはGHSRおよびCCK1Rに陽性であった。
プロファイルには、ノドーズガングリオンのロストラル部分にPhox2bおよびCCK1Rトランスクリプトの両方が含まれていました。無用量無フェレントニューロンにおける多重ISHの結果として、Phox2bシグナルは、特に無用量神経節に位置する無フェレントニューロンに蓄積された。CCK1R シグナルは、無用量神経節の多くのニューロンを強烈に標識した。
低倍率では、低いCCK1RまたはGSHR信号を発現する細胞は容易に観察できなかった。DapBは、組織を視覚化し、大きく軽く染色された核を持つ迷走性の無呼吸ニューロンを同定するのに役立ちました。高倍率では、Phox2b陽性プロファイルが明らかである。
プロファイル2および3は、高および中等度のCCK1Rシグナルを有するPhox2b細胞である。プロファイル4は、GHSRおよびCCK1Rの両方を発現した。頸管不フェレントニューロンの多重化のISHの結果として、PRDM12転写産物は、頸神経節に位置する不発泡ニューロンに特異的に蓄積されて見ることができた。
高倍率では、CCK1Rの中程度の信号がプロファイル1と2で検出されました。プロファイル3は、CCK1RまたはGHSRに対する陰性のPRDM12細胞の代表である。解剖の一貫性は重要な要素です。
イメージング取得パラメータが望ましくないバックグラウンド信号を生成しないことを確認することも同様に重要です。多重化イン・シン・ハイブリダイゼーションは、特に神経解剖学の分野において確立された分子におけるゴールドスタンダードとなっている。この方法は、免疫体化学と容易に組み合わせることができる。
