このプロトコルは、正常および病理学的条件下での神経筋接合部の完全性および可塑性を評価するために使用することができる。この技術は、単一の筋肉切片上のシュワン細胞および前後の実験動物を同時に標識することである。成体雄ラットを安楽死させた後、ラットをフードに入れ、胸腔を開き、はさみおよび鉗子を使用して心臓にアクセスする。
左心室から大動脈に向かって静脈内カテーテルを挿入し、右オラクルを切断する。次に、右オラクルから出る血液が透明になるまで、100ミリリットルの0.9%の通常の生理食塩水で灌流を開始します。次いで、0.1モルリン酸緩衝液またはPB pH 7.4中の250〜300ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドを10分間灌流し続ける。
灌流後、手術刃を用いて両側後肢の皮膚を除去し、両側坐骨神経と内側腓腹筋を露出させる。刃を用いて両側内側腓腹筋を後肢から注意深く解剖し、筋肉全体を10ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドで後置する。2時間後、溶液から筋肉を取り出し、摂氏4度で1日間、0.1モルPB中の25%スクロースを10ミリリットルで凍結保護する。
筋肉組織がスクロース溶液に浸漬されたら、凍結切片培地を用いてスライドミクロトームシステムの凍結段階で固定する。筋肉の長軸に沿って80ミクロンの厚さで筋肉を水平にスライスします。ブラシを使用して、10ミリリットルの0.1モルPBを有する6ウェル培養プレートに、ウェル当たり7つのクライオ切片を整然と配置する。蛍光染色のために、1ウェルあたり4つの切片を、75マイクロリットルの10%Triton X 100および45マイクロリットルの正常なロバ血清を含む1.5ミリリットルの0.1モルPBと共に、20rpmのオービタルシェーカー上でインキュベートする。
30分後、切片をウサギ抗神経フィラメント200、ヤギ抗小胞性アセチルコリントランスポーターを0.1モルPB中、1%正常ロバ血清中、および0.5%Triton X 100中の一次抗体の混合溶液の1.5ミリリットルに移し、摂氏4度で一晩インキュベートする。翌日、切片を20rpmのオービタルシェーカー中で0.1モルPB上でそれぞれ5分間3回洗浄する。最後の洗浄後、ロバ抗ウサギAF 488およびロバ抗ヤギAF 546、ならびにアルファバンガロ毒素のバイオマーカーを含む2次抗体の混合溶液中で切片を1%正常ロバ血清および0.5トリトンx 100を含む0.1M PB中に含有するAF 647およびファロイジン350の混合溶液中で1時間インキュベートし、 彼らを光から守る。
インキュベーション後、切片をPBで洗浄し、顕微鏡スライドにマウントします。蒸留水中に50%グリセリンを使用してカバーガラスをセクションに塗布します。開口数0.75の20倍の主観レンズと0.95の開口数40倍のレンズを備えたコンフォーカルイメージングシステムを用いて標本を観察し、画像化する。
多重蛍光イメージングの場合、テキスト原稿に記載されているように、各バイオマーカーの励起波長と発光波長を設定します。画像キャプチャの解像度を 640 x 640 ピクセルに設定します。次に、開始焦点面と終了焦点面を設定します。
ステップサイズを1ミクロンまたは2ミクロンに設定します。次に、深度パターン、画像キャプチャ、および Z シリーズを選択します。20 X の低倍率の画像の場合は、105 ミクロンのピンホールを使用して、2 ミクロンのステップ サイズで 40 Z のスタック画像をキャプチャします。
投影またはトポグラフィモードとZ軸上の強度投影を選択して、すべての画像を1つのフォーカスに統合します。40 X の高倍率画像の場合は、ズームを 2 に設定し、105 ミクロンのピンホールで 80 Z スタック画像を 1 ミクロン ステップ サイズでキャプチャします。すべての画像を1つのフォーカスに統合します。
画像処理システムで3次元パターンの画像を再構成する。内側腓腹筋と神経フィラメント200陽性神経線維、小胞性アセチルコリントランスポーター陽性シナプス前末端、αバンガロ毒素陽性シナプス後アセチルコリン受容体、S100陽性シナプス周囲シュワン細胞、ファロイジン陽性筋線維、およびDAPI標識細胞核との代表的な空間相関がここで実証される。ニューロフィラメント200の陽性神経線維が束ねて走った。
これらの神経線維は、小胞性アセチルコリントランスポーター陽性シナプス前末端に分岐を与え、これはアルファバンガロ毒素陽性シナプス後アセチルコリン受容体との鏡面関係を形成した。さらに、S100陽性シナプス周囲シュワン細胞を、シナプス前終末に近い200個の陽性神経線維のニューロフィラメントの周囲に検出した。空間的相関は、異なる観点から神経筋接合部の詳細な形態学的特徴を示す3次元パターンでさらに示された。
筋肉切片でより多くのイメージングを観察するためには、筋肉を80ミクロンの厚さで長軸に沿って水平にスライスすることが重要です。
