أثناء تكون الدم ، تخضع الخلايا الجذعية المكونة للدم لتحول استقلابي من تحلل السكر إلى الفسفرة التأكسدية. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتقييم وظائف تحلل السكر والميتوكوندريا للخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية. يمكن استخدام هذه الطريقة لتقييم الطاقة الحيوية الخلوية في الوقت الفعلي.
توفر المنصة القائمة على الصفائح الدقيقة التي يبلغ عددها 96 بئرا تقديرا كميا عالي الإنتاجية مع حساسية عالية ، مما يسمح بالتحليل المتزامن لعينات متعددة باستخدام لوحة واحدة. يمكن استخدام هذه التقنية للتحقيق في آثار المواد الكيميائية أو التلاعب الجيني على استقلاب HSC في ظل ظروف متنوعة. يمكن أن يساعد في توضيح المسارات الأيضية التي تحافظ على تعدد قدرات HSC.
على الرغم من أن الدراسة الحالية تركز بشكل أساسي على السيقان المكونة للدم في الفئران والخلايا السلفية ، إلا أنه يمكن بسهولة تكييف البروتوكول وهذا النهج لتحسين ظروف التحليل لأي نوع من الخلايا المعلقة. قبل يوم واحد من الفحص ، افتح مجموعة فحص التدفق خارج الخلية لإزالة خرطوشة المستشعر وتجميع لوحة المرافق. احفظ شقق دليل التحميل لاستخدامها في اليوم التالي.
الآن افصل خرطوشة المستشعر يدويا عن لوحة الأداة المساعدة وضعها رأسا على عقب بجوار لوحة الأداة المساعدة. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، املأ كل بئر من لوحة المرافق ب 200 ميكرولتر من العيار المضمن في مجموعة فحص التدفق ، ثم ضع خرطوشة المستشعر مرة أخرى على لوحة المرافق ، مع التأكد من غمر المستشعرات بالكامل في العيار. ثم احتضن لوحة المرافق بخرطوشة مستشعر معايرة ومجمعة في حاضنة غير ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها بعد ظروف الترطيب المذكورة في المخطوطة.
في يوم الفحص ، قم بإعداد 2.5 ملليلتر من محلول لاصق الخلية لكل صفيحة صغيرة لزراعة الخلايا في 96 بئرا كما هو موضح في مخطوطة النص. افتح الصفيحة الدقيقة لزراعة الخلايا المكونة من 96 بئرا المضمنة في مجموعة فحص التدفق وقم بتوزيع 25 ميكرولتر من محلول لاصق الخلية المحضر في قاع كل بئر. قم بتغطية الصفيحة الدقيقة بالغطاء واحتضنها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة داخل الغطاء.
بعد الحضانة ، قم بإزالة والتخلص من محلول لاصق الخلايا الزائد باستخدام ماصة متعددة القنوات أو شفاط واغسل كل بئر مرتين ب 200 ميكرولتر من الماء المعقم فائق النقاء. جفف اللوحة بالهواء بدون غطاء داخل الغطاء لمدة 30 إلى 45 دقيقة. جهاز الطرد المركزي لسلالة الفأر المعدة سلبية HSPCs عند 200 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
بعد التخلص من السوبرناتانت ، أعد تعليق بيليه الخلية في وسط الفحص المناسب ، ومرة أخرى الطرد المركزي لتعليق الخلية. كرر هذا الإجراء مرة أخرى وأعد تعليق الخلايا في وسط الفحص الدافئ المناسب بتركيز 250،000 خلية لكل 50 ميكرولتر أو خمسة ملايين خلية لكل ملليلتر. استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 50 ميكرولتر من تعليق الخلية على طول جانب كل بئر من الصفيحة الدقيقة لزراعة الخلايا المغلفة بالمادة اللاصقة للخلية 96 بئرا ، ثم أضف 50 ميكرولتر من وسيط الفحص إلى آبار قياس خلفية الزاوية.
قم بإنشاء لوحة توازن أجهزة الطرد المركزي عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من الماء لكل بئر من صفيحة صغيرة غير مغلفة من 96 بئرا لزراعة الخلايا. الطرد المركزي للخلايا في 200 مرة G لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. احتضان الصفيحة في حاضنة غير ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية لمدة 25 إلى 30 دقيقة لمرفق الخلية.
بعد 30 دقيقة ، تأكد بصريا تحت المجهر من أن الخلايا ملتصقة بثبات بسطح الصفيحة الدقيقة. ابدأ بإعداد جميع الحلول المطلوبة في وسيط فحص إجهاد تحلل السكر المسخن مسبقا كما هو مذكور في مخطوطة النص وقم بإزالة خرطوشة المستشعر المائي من الحاضنة. ارفع خرطوشة المستشعر من العيار واستبدلها على نفس لوحة الأداة بالمعايرة لإزالة فقاعات الهواء.
ضع دليل التحميل 80 مسطحا في الجزء العلوي من خرطوشة المستشعر التي توجهها بحيث يكون الحرف A موجودا في الزاوية العلوية اليسرى. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، قم بتوزيع 20 ميكرولتر من محلول الجلوكوز 100 مللي مولا في المنفذ A.استبدل دليل التحميل 80 مسطحا بدليل تحميل BC مسطحا ، مع توجيه الحرف B في الزاوية العلوية اليسرى. قم بتوزيع 22 ميكرولتر من محلول أوليغوميسين ميكرومولار 20 ميكرومولار في المنفذ B.أعد توجيه دليل تحميل BC مسطحا لتحديد موقع الحرف C في الزاوية العلوية اليسرى لتحميل المنفذ C وقم بتوزيع 25 ميكرولتر من محلول 500 millimolar 2-deoxy-d-glucose في المنفذ C.ثم قم بإزالة وتجاهل مسطحات دليل التحميل.
الآن قم بإنشاء أو تحميل القالب لاختبار إجهاد تحلل السكر على وحدة التحكم. أدخل التفاصيل المتعلقة باستراتيجيات الحقن وظروف العلاج وأنواع الخلايا، واضغط على إنشاء مجموعات. انتقل إلى خريطة اللوحة وقم بتعيين آبار لكل مجموعة ليتم تحليلها.
في البروتوكول، تأكد من التحقق من المعايرة والتوازن في خطوة التهيئة. بالنسبة للقياس الأساسي والقياسات بعد كل حقنة ، اضبط عدد دورات القياس على ثلاث دورات واخلط وانتظر وقياس الأوقات إلى ثلاث دقائق وصفر دقائق وثلاث دقائق. انقر فوق بدء التشغيل على البرنامج.
قم بإزالة الغطاء من خرطوشة المستشعر المحملة والمائية بالمركبات وضعها على درج العمل الخاص بمحلل التدفق خارج الخلية. ابدأ تشغيل المعايرة. أخرج الصفيحة الدقيقة التي تحتوي على الخلايا البذرية من الحاضنة.
دون إزعاج الخلايا ، أضف ببطء 130 ميكرولتر من اختبار إجهاد تحلل السكر المسخن مسبقا متوسط لكل بئر لتكوين الحجم المتوسط في كل بئر إلى 180 ميكرولتر وإعادة اللوحة إلى الحاضنة لمدة 15 إلى 20 دقيقة إضافية. انقر فوق فتح الدرج على البرنامج لفتح الدرج الحراري لفرس البحر. بعد انتهاء المعايرة، استبدل لوحة الأداة المساعدة بلوحة الفحص الدقيقة هذه التي تحتوي على الخلايا واضغط على لوحة خلية التحميل لبدء القياسات.
بعد انتهاء القياسات ، قم بإزالة وسيط الفحص من اللوحة دون إزعاج الخلايا واغسلها بلطف ب 250 ميكرولتر من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات دون إزاحة الخلايا. الآن أضف 10 ميكرولترات من المخزن المؤقت لتحلل الترسيب المناعي الإشعاعي المكمل بكوكتيل مثبط للأنزيم البروتيني 1X إلى كل بئر وحرك الطبق على شاكر لمدة 10 دقائق. قم بتجميد اللوحة بأكملها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.
قم بإذابة اللوحة وقم بإجراء فحص قياس البروتين لتطبيع البيانات باتباع تعليمات الشركة المصنعة. استرجع البيانات وقم بتحليلها عن طريق فتح ملف البيانات باستخدام برنامج Wave لسطح المكتب. انقر فوق تطبيع ، والصق قيم التطبيع لكل بئر ثم انقر فوق تطبيق لتطبيع البيانات.
انقر فوق تصدير وحدد مولد تقرير اختبار إجهاد تحلل السكر لتصدير البيانات التي تم تحليلها إلى مولد تقرير. يرتفع معدل التحمض غير المحلل للسكري مع زيادة عدد الخلايا من 50،000 إلى 250،000 ، ولكنه يزيد فقط بشكل ضئيل بين 200،000 إلى 250،000. حقن الجلوكوز 10 ملليمولار يحفز تحلل السكر في جميع أعداد الخلايا مع زيادة قصوى في ECAR لوحظ في 250،000 خلية لكل بئر.
ومع ذلك ، فإن حقن اثنين من الميكرومولار من oligomycin لا يزيد من ECAR. تظهر بيانات التعرف الضوئي على الحروف التي تم الحصول عليها في نفس المجموعة من اختبارات إجهاد تحلل السكر انخفاضا كبيرا بعد حقن الأوليغوميسين بسبب تثبيط 5 المعقد. تم حساب معلمات اختبار إجهاد تحلل السكر وتم اختيار 250،000 خلية لكل بئر في اثنين من الميكرومولات من oligomycin لمزيد من الدراسات.
أظهر اختبار إجهاد الميتوكوندريا أن حقنتين أوليغوميسين ميكرومولار تسببان انخفاضا كبيرا في التعرف الضوئي على الحروف عن طريق تثبيط المركب 5. يحفز FCCP التعرف الضوئي على الحروف في HSPCs بطريقة تعتمد على الجرعة مع زيادة قصوى لوحظت في اثنين من المولار الدقيقة. مزيج من 0.5 ميكرومولار روتينون و 0.5 ميكرومولار مضاد للمايسين حقن يقلل من التعرف الضوئي على الحروف إلى أدنى مستوى له يتوافق مع استهلاك الأكسجين غير الميتوكوندريا.
تم حساب معلمات اختبار إجهاد الميتوكوندريا وتم اختيار اثنين من الميكرومولار من FCCP لمزيد من الدراسات. وبالنظر إلى طبيعة الإنتاجية العالية لهذه التقنية، يمكن بسهولة تكييف البروتوكول الموصوف هنا لفحص عدد كبير من المعدلات الحيوية في الخلايا الجذعية المكونة للدم، والأسلاف المكونة للدم، والخلايا المكونة للدم الخبيثة. يستخدم تحليل فرس البحر على نطاق واسع في الأدبيات لقياس التمثيل الغذائي في مجموعة واسعة من السياقات في وجود العديد من الركائز والمثبطات.
