Hematopoez sırasında, hematopoetik kök hücreler glikolizden oksidatif fosforilasyona metabolik bir geçişe uğrar. Bu protokol, fare hematopoetik kök ve progenitör hücrelerinin glikolitik ve mitokondriyal fonksiyonlarını değerlendirmek için kullanılabilir. Bu yöntem, hücresel biyoenerjetik kaynakları gerçek zamanlı olarak değerlendirmek için kullanılabilir.
96 delikli mikroplaka tabanlı platform, yüksek hassasiyetle yüksek verim ölçümü sunarak tek bir plaka kullanarak birden fazla numunenin aynı anda analiz edilmesini sağlar. Bu teknik, kimyasalların veya genetik manipülasyonların HSC metabolizması üzerindeki etkilerini çeşitli koşullar altında araştırmak için kullanılabilir. HSC pluripotensini sürdüren metabolik yolakların aydınlatılmasına yardımcı olabilir.
Mevcut çalışma esas olarak fare hematopoetik gövdelerine ve progenitör hücrelerine odaklanmış olsa da, protokol ve bu yaklaşım, her türlü süspansiyon hücresi için analiz koşullarını optimize etmek için kolayca uyarlanabilir. Tahlilden bir gün önce, sensör kartuşunu ve yardımcı plaka tertibatını çıkarmak için hücre dışı akı analiz kitini açın. Yükleme kılavuzu dairelerini ertesi gün kullanmak üzere saklayın.
Şimdi sensör kartuşunu yardımcı plakadan manuel olarak ayırın ve yardımcı plakanın yanına baş aşağı yerleştirin. Çok kanallı bir pipet kullanarak, yardımcı plakanın her bir oluğunu, akı testi kitiyle birlikte verilen 200 mikrolitre kalibranla doldurun, ardından sensör kartuşunu tekrar yardımcı plakaya yerleştirin ve sensörleri kalibarta tamamen batırdığınızdan emin olun. Daha sonra, yardımcı plakayı kalibrant ve monte edilmiş sensör kartuşu ile birlikte, makalede belirtilen nemlendirme koşullarını takiben gece boyunca 37 santigrat derecede karbondioksit olmayan bir inkübatörde inkübe edin.
Tahlil gününde, metin yazısında açıklandığı gibi 96 delikli hücre kültürü mikroplakası başına 2,5 mililitre hücre yapışkan çözeltisi hazırlayın. Akı tahlil kiti ile birlikte verilen 96 delikli hücre kültürü mikro plakasını açın ve hazırlanan hücre yapıştırıcı çözeltisinin 25 mikrolitresini her bir kuyucuğun dibine dağıtın. Mikro plakayı kapakla örtün ve kaputun içindeki oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.
Kuluçkadan sonra, çok kanallı bir pipet veya aspiratör kullanarak fazla hücre yapıştırıcı çözeltisini çıkarın ve atın ve her bir oyuğunu 200 mikrolitre steril ultra saf su ile iki kez yıkayın. Kaputun içindeki kapak olmadan plakayı 30 ila 45 dakika boyunca hava ile kurutun. Hazırlanan fare soyu negatif HSPC'leri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 200 kez G'de santrifüj yapın.
Süpernatanı attıktan sonra, hücre peletini uygun tahlil ortamında yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonunu tekrar santrifüj edin. Bu prosedürü bir kez daha tekrarlayın ve uygun ısıtılmış tahlil ortamındaki hücreleri, 50 mikrolitre başına 250.000 hücre veya mililitre başına beş milyon hücre konsantrasyonuna kadar askıya alın. Hücre yapıştırıcısı kaplı 96 delikli hücre kültürü mikro plakasının her bir kuyucuğunun yan tarafına 50 mikrolitre hücre süspansiyonu eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın, ardından köşe arka plan ölçüm kuyularına 50 mikrolitre tahlil ortamı ekleyin.
Kaplamasız 96 delikli hücre kültürü mikro plakasının kuyusuna 50 mikrolitre su ekleyerek bir santrifüj denge plakası oluşturun. Hücreleri oda sıcaklığında bir dakika boyunca 200 kez G'de santrifüj yapın. Plakayı karbondioksit olmayan bir inkübatörde hücre bağlantısı için 25 ila 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
30 dakika sonra, mikroskop altında hücrelerin mikroplaka yüzeyine kararlı bir şekilde yapıştığını görsel olarak onaylayın. Metin yazısında belirtildiği gibi önceden ısıtılmış glikoliz stres testi ortamında gerekli tüm çözeltileri hazırlayarak başlayın ve hidratlanmış sensör kartuşunu inkübatörden çıkarın. Sensör kartuşunu kalibranttan çıkarın ve hava kabarcıklarını gidermek için kalibranla aynı yardımcı plaka üzerine yerleştirin.
80 yükleme kılavuzunu sensör kartuşunun üst kısmına düz bir şekilde yerleştirin ve A harfi sol üst köşede olacak şekilde yönlendirin. Çok kanallı pipet kullanarak, A bağlantı noktasına 20 mikrolitre 100 milimolar glikoz çözeltisi dağıtın.80 yükleme kılavuzu düzlüğünü, B harfini sol üst köşeye yönlendirerek BC yükleme kılavuzu düzlüğüyle değiştirin. B portunda 22 mikrolitre 20 mikromolar oligomisin çözeltisi dağıtın.C portunu yüklemek için sol üst köşedeki C harfini bulmak için BC yükleme kılavuzunu düz bir şekilde yeniden yönlendirin ve C portunda 25 mikrolitre 500 milimolar 2-deoksi-d-glukoz çözeltisi dağıtın.
Şimdi kontrolörde glikoliz stres testi için şablon oluşturun veya yükleyin. Enjeksiyon stratejileri, tedavi koşulları ve hücre tipleri ile ilgili ayrıntıları girin ve Grup Oluştur'a basın. Plaka haritasına gidin ve analiz edilecek her gruba kuyular atayın.
Protokolde, kalibrasyon ve dengenin başlatma adımında kontrol edildiğinden emin olun. Her enjeksiyondan sonraki temel ölçüm ve ölçümler için, ölçüm döngülerinin sayısını üçe ayarlayın ve karıştırın, bekleyin, ölçüm sürelerini üç dakikaya, sıfır dakikaya, üç dakikaya ayarlayın. Yazılımda Start Run (Çalıştırmayı Başlat) düğmesini tıklatın.
Kapağı yüklü ve hidratlanmış bileşikler sensör kartuşundan çıkarın ve hücre dışı akı analizörünün çalışma tepsisine yerleştirin. Kalibrasyon çalışmasına başlayın. Tohumlanmış hücreleri içeren mikro plakayı inkübatörden çıkarın.
Hücreleri rahatsız etmeden, her bir kuyucuktaki orta hacmi 180 mikrolitreye çıkarmak için kuyu başına önceden ısıtılmış glikoliz stres testi test ortamından yavaşça 130 mikrolitre ekleyin ve plakayı 15 ila 20 dakika daha inkübatöre geri koyun. Seahorse'un termal tepsisini açmak için yazılımdaki Tepsiyi Aç'a tıklayın. Kalibrasyon bittikten sonra, yardımcı plakayı hücreleri içeren bu tahlil mikro plakasıyla değiştirin ve ölçümleri başlatmak için Yük Hücresi Plakasına basın.
Ölçümler bittikten sonra, hücreleri rahatsız etmeden tahlil ortamını plakadan çıkarın ve hücreleri yerinden oynatmadan 250 mikrolitre fosfat tamponlu salin ile nazikçe yıkayın. Şimdi her bir oyuğa 1X proteaz inhibitörü kokteyli ile desteklenmiş 10 mikrolitre radyoimmünopresipitasyon lizis tamponu ekleyin ve plakayı 10 dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerinde çalkalayın. Tüm plakayı eksi 80 santigrat derecede dondurun.
Plakayı çözün ve üreticinin talimatlarını izleyerek veri normalizasyonu için bir protein ölçüm testi yapın. Wave masaüstü yazılımını kullanarak veri dosyasını açarak verileri alın ve analiz edin. Normalleştir'e tıklayın, her bir kuyucuk için normalleştirme değerlerini yapıştırın ve ardından verileri normalleştirmek için Uygula'ya tıklayın.
Dışa Aktar'a tıklayın ve analiz edilen verileri bir rapor üreticisine aktarmak için glikoliz stres testi raporu üretecini seçin. Glikolitik olmayan asitleşme oranı, hücre sayısının 50.000'den 250.000'e yükselmesiyle yükselir, ancak 200.000 ila 250.000 arasında sadece minimum düzeyde artar. 10 milimolar glikoz enjeksiyonu, kuyu başına 250.000 hücrede gözlenen ECAR'da maksimum bir artışla tüm hücre numaralarında glikolizi uyarır.
Bununla birlikte, iki mikromolar oligomisin enjeksiyonu ECAR'ı daha da arttırmaz. Aynı glikoliz stres testleri setinde elde edilen OCR verileri, kompleks 5 inhibisyonu nedeniyle oligomisin enjeksiyonunu takiben önemli bir düşüş göstermektedir. Glikoliz stres testi parametreleri hesaplandı ve daha ileri çalışmalar için iki mikromolar oligomisinde kuyu başına 250.000 hücre seçildi.
Mitokondriyal stres testi, iki mikromolar oligomisin enjeksiyonunun, kompleks 5'in inhibisyonu yoluyla OCR'de önemli bir azalmaya neden olduğunu göstermiştir. FCCP, HSPC'lerde OCR'yi doza bağımlı bir şekilde uyarır ve iki mikromolar'da gözlenen maksimum artış olur. 0.5 mikromolar rotenon ve 0.5 mikromolar antimisin A enjeksiyonunun bir karışımı, OCR'yi mitokondriyal olmayan oksijen tüketimine karşılık gelen minimum seviyesine düşürür.
Mitokondriyal stres testi parametreleri hesaplandı ve daha ileri çalışmalar için iki mikromolar FCCP seçildi. Bu tekniğin yüksek verimli doğası göz önüne alındığında, burada açıklanan protokol, hematopoetik kök hücrelerde, hematopoetik progenitörlerde ve malign hematopoetik hücrelerde çok sayıda biyoenerjetik modülatörün taranması için kolayca uyarlanabilir. Denizatı analizi, literatürde, çeşitli substratların ve inhibitörlerin varlığında çok çeşitli bağlamlarda metabolizmayı ölçmek için yaygın olarak kullanılmaktadır.
