Durante a hematopoiese, as células-tronco hematopoiéticas sofrem uma mudança metabólica da glicólise para a fosforilação oxidativa. Este protocolo pode ser usado para avaliar funções glicolíticas e mitocondriais de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras do rato. Este método pode ser usado para avaliar bioenergésicos celulares em tempo real.
A plataforma baseada em microplacos de 96 poços oferece quantificação de alto rendimento com alta sensibilidade, permitindo a análise simultânea de várias amostras usando uma única placa. Esta técnica pode ser usada para sondar os efeitos de produtos químicos ou manipulações genéticas no metabolismo do HSC em condições variadas. Pode ajudar a elucidar vias metabólicas que sustentam a pluripotência do HSC.
Embora o presente estudo seja focado principalmente em hastes hematopoiéticas de camundongos e células progenitoras, o protocolo e essa abordagem poderiam ser facilmente adaptados para otimizar condições de análise para qualquer tipo de células de suspensão. Um dia antes do ensaio, abra o kit de ensaio de fluxo extracelular para remover o cartucho do sensor e o conjunto da placa de utilidade. Guarde os planos de guia de carga para uso no dia seguinte.
Agora, separe manualmente o cartucho do sensor da placa do utilitário e coloque-o de cabeça para baixo ao lado da placa de utilidade. Usando uma pipeta multicanal, encha cada poço da placa de utilidade com 200 microliters de calibrante incluídos no kit de ensaio de fluxo, em seguida, coloque o cartucho do sensor de volta na placa de utilidade, certificando-se de submergir completamente os sensores no calibrante. Em seguida, incubar a placa de utilidade com cartucho de sensor calibrado e montado em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius durante a noite após as condições umidificantes mencionadas no manuscrito.
No dia do ensaio, prepare 2,5 mililitros da solução adesiva celular por microplacar de cultura celular de 96 poços, conforme descrito no manuscrito do texto. Abra a microplacar de cultura celular de 96 poços incluída com o kit de ensaio de fluxo e dispense 25 microliters da solução adesiva celular preparada na parte inferior de cada poço. Cubra a microplacão com a tampa e incubar por 30 minutos em temperatura ambiente dentro do capô.
Após a incubação, remova e descarte a solução de adesivo de célula em excesso usando uma pipeta ou aspirador multicanal e lave cada poço duas vezes com 200 microliters de água ultrapura estéril. Aere a placa sem a tampa dentro do capô por 30 a 45 minutos. Centrifugar os HSPCs negativos da linhagem do mouse preparados a 200 vezes G durante cinco minutos à temperatura ambiente.
Depois de descartar o supernaspe, resuspenque a pelota celular no meio de ensaio apropriado e, novamente, centrifugar a suspensão celular. Repita este procedimento mais uma vez e resuspenque as células no médio de ensaio aquecido apropriado para a concentração de 250.000 células por 50 microliters ou cinco milhões de células por mililitros. Use uma pipeta multicanal para adicionar 50 microliters da suspensão celular ao longo da lateral de cada poço da microplaca de cultura celular revestida de 96 poços, em seguida, adicione 50 microliters do meio de ensaio nos poços de medição de fundo do canto.
Crie uma placa de equilíbrio centrífuga adicionando 50 microliters de água por poço de uma microplacão de cultura celular de 96 poços não revestido. Centrifugar as células a 200 vezes G por um minuto à temperatura ambiente. Incubar a placa em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por 25 a 30 minutos para fixação celular.
Após 30 minutos, confirme visualmente sob um microscópio que as células são aderidas à superfície da microplacão. Comece preparando todas as soluções necessárias no teste de estresse de glicolise pré-aquecido, conforme mencionado no manuscrito do texto e remova o cartucho de sensor hidratado da incubadora. Retire o cartucho do sensor para fora do calibrante e substitua-o na mesma placa de utilidade pelo calibrante para remover as bolhas de ar.
Coloque o guia de carga 80 plano na parte superior do cartucho do sensor orientando-o para que a letra A esteja localizada no canto superior esquerdo. Utilizando uma pipeta multicanal, dispense 20 microliters de 100 mililitros de solução de glicose na porta A.Substitua a guia de carregamento 80 plana com a guia de carregamento BC plana, orientando a letra B no canto superior esquerdo. Dispense 22 microliters de 20 soluçãos de oligomicina micromolar na porta B.Reoriente o guia de carregamento BC plano para localizar a letra C no canto superior esquerdo para carregar a porta C e dispensar 25 microlitres de 500 mililitros 2-desoxy-d-glicose solução na porta C.Em seguida, remova e descarte os planos de guia de carga.
Agora crie ou carregue o modelo para o teste de estresse da glicolise no controlador. Insira os detalhes sobre estratégias de injeção, condições de tratamento e tipos de células, e pressione Gerar Grupos. Vá para o mapa da placa e atribua poços a cada grupo a ser analisado.
No protocolo, certifique-se de que a calibração e o equilíbrio sejam verificados na etapa de inicialização. Para a medição e as medidas da linha de base após cada injeção, defina o número de ciclos de medição para três e misture, espere, meça os tempos para três minutos, zero minutos, três minutos. Clique em Iniciar execução no software.
Remova a tampa dos compostos carregados e o cartucho hidratado do sensor e coloque-a na bandeja de trabalho do analisador de fluxo extracelular. Comece a corrida de calibração. Retire a microplaca contendo as células semeadas da incubadora.
Sem perturbar as células, adicione lentamente 130 microliters do teste de estresse de glicolise pré-aquecido para compor o volume médio em cada poço para 180 microliters e devolva a placa à incubadora por mais 15 a 20 minutos. Clique em Abrir bandeja no software para abrir a bandeja térmica do Seahorse. Após o fim da calibração, substitua a placa de utilidade por esta microplacão de ensaio contendo as células e pressione a placa da célula de carga para iniciar as medições.
Após o fim das medições, remova o meio de ensaio da placa sem perturbar as células e lave-as suavemente com 250 microliters de soro fisiológico tamponado de fosfato sem desalojar as células. Agora adicione 10 microliters de tampão de radioimunoprecipitação suplementado com coquetel inibidor de protease 1X para cada poço e agitar a placa em um agitador por 10 minutos. Congele a placa inteira a menos 80 graus Celsius.
Descongele a placa e realize um ensaio de medição de proteínas para normalização dos dados seguindo as instruções do fabricante. Recupere e analise os dados abrindo o arquivo de dados usando o software de desktop Wave. Clique em Normalizar, cole os valores de normalização para cada poço e clique em Aplicar para normalizar os dados.
Clique em Exportar e selecione gerador de relatório de teste de estresse de glicolise para exportar os dados analisados para um gerador de relatórios. A taxa de acidificação não glicolítico sobe com o aumento do número celular de 50.000 para 250.000, mas aumenta apenas minimamente entre 200.000 e 250.000. A injeção de 10 milimonas de glicose estimula a glicólise em todos os números celulares com um aumento máximo no ECAR observado em 250.000 células por poço.
No entanto, a injeção de dois micromolar de oligomicina não aumenta ainda mais o ECAR. Os dados de OCR obtidos no mesmo conjunto de testes de estresse de glicolise mostram uma queda significativa após a injeção de oligomicina devido à inibição complexa 5. Foram calculados parâmetros de teste de estresse da glicólise e 250 mil células por poço em dois micromolar de oligomicina foram selecionadas para estudos posteriores.
O teste de estresse mitocondrial mostrou que duas injeção de oligomicina micromolar causam uma redução significativa no OCR através da inibição do complexo 5. A FCCP estimula o OCR em HSPCs de forma dependente de doses com um aumento máximo observado em dois micromolar. Uma mistura de rotenona micromolar de 0,5 micromolar e 0,5 antimicina micromolar A a injeção diminui o OCR ao seu nível mínimo correspondente ao consumo de oxigênio não mitocondrial.
Foram calculados parâmetros de teste de estresse mitocondrial e selecionados dois micromolares de FCCP para estudos posteriores. Dada a natureza de alto rendimento desta técnica, o protocolo descrito aqui poderia ser facilmente adaptado para tela um grande número de moduladores bioenergésicos em células-tronco hematopoiéticas, progenitores hematopoiéticos e células hematopoiéticas malignas. A análise de cavalos marinhos é amplamente utilizada na literatura para medir o metabolismo em uma ampla variedade de contextos na presença de vários substratos e inibidores.
