使用细胞外通量分析仪评估小鼠造血干细胞和原始祖细胞中的细胞生物能量学

在造血过程中，造血干细胞经历从糖酵解到氧化磷酸化的代谢转换。该方案可用于评估小鼠造血干细胞和祖细胞的糖酵解和线粒体功能。该方法可用于实时评估细胞生物能量学。

基于96孔微孔板的平台提供高通量定量和高灵敏度，允许使用单个板同时分析多个样品。该技术可用于探测化学物质或遗传操作在各种条件下对HSC代谢的影响。它可以帮助阐明维持HSC多能性的代谢途径。

虽然目前的研究主要集中在小鼠造血干细胞和祖细胞上，但该方案和这种方法可以很容易地适应任何类型的悬浮细胞的分析条件。在测定前一天，打开细胞外通量测定试剂盒以取出传感器盒和实用板组件。保存装载导轨平底，以备第二天使用。

现在，手动将传感器盒与实用板分开，并将其倒置在实用板旁边。使用多通道移液器，用助焊剂测定试剂盒随附的200微升校准剂填充实用板的每个孔，然后将传感器盒放回实用程序板上，确保将传感器完全浸入校准剂中。然后，在手稿中提到的加湿条件下，在37摄氏度的非二氧化碳培养箱中，将实用板与校准剂和组装的传感器盒一起孵育过夜。

在测定当天，如文本手稿中所述，每96孔细胞培养微孔板制备2.5毫升细胞粘合剂溶液。打开助焊剂测定试剂盒随附的96孔细胞培养微孔板，并在每个孔的底部分配25微升制备的细胞粘合剂溶液。用盖子盖住微孔板，在室温下在罩内孵育30分钟。

孵育后，使用多通道移液器或吸出器除去并丢弃多余的细胞粘合剂溶液，并用200微升无菌超纯水洗涤每个孔两次。将不带盖子的板风干30至45分钟。在室温下将制备的小鼠谱系负性HSPCs以200倍G离心5分钟。

丢弃上清液后，将细胞沉淀重悬于适当的测定培养基中，并再次离心细胞悬浮液。再次重复该过程，并将细胞重悬于适当的加热测定培养基中，浓度为每50微升250， 000个细胞或每毫升500万个细胞。使用多通道移液器沿每个孔的细胞粘合剂包被的96孔细胞培养微孔板的侧面加入50微升的细胞悬浮液，然后将50微升的测定培养基加入角背景测量孔中。

通过每孔非包被的96孔细胞培养微孔板添加50微升水来创建离心机平衡板。在室温下以200倍G离心细胞一分钟。将板在37摄氏度的非二氧化碳培养箱中孵育25至30分钟以进行细胞附着。

30分钟后，在显微镜下目视确认细胞稳定地粘附在微孔板表面。首先在预热的糖酵解胁迫测试测定培养基中制备所有必需的溶液，如文本手稿中所述，并从培养箱中取出水合传感器盒。将传感器盒从校准剂中取出，并将其与校准剂放在同一实用板上，以去除气泡。

将 80 装载导轨平放在传感器盒的顶部，使其定位，使字母 A 位于左上角。使用多通道移液器，在端口A中分配20微升100毫摩尔葡萄糖溶液，将80加载导轨平放，将BC加载导轨平放，将字母B定向到左上角。在端口B中分配22微升20微摩尔寡霉素溶液，将BC装载导轨重新定位为平坦，以将字母C定位在左上角，用于装载端口C，并在端口C中分配25微升500毫摩尔2-脱氧-d-葡萄糖溶液，然后取下并丢弃装载导轨平板。

现在，在控制器上创建或加载糖酵解压力测试的模板。输入有关注射策略、治疗条件和细胞类型的详细信息，然后按生成组。转到板块图并将孔分配给要分析的每个组。

在协议中，确保在初始化步骤中检查校准和平衡。对于基线测量和每次注射后的测量，将测量周期数设置为三次，混合，等待，测量时间为三分钟，零分钟，三分钟。单击开始运行在软件上。

从装填的化合物和水合传感器盒中取下盖子，并将其放在细胞外通量分析仪的工作托盘上。开始校准运行。从培养箱中取出含有接种细胞的微孔板。

在不干扰细胞的情况下，每孔缓慢加入130微升预热的糖酵解胁迫试验培养基，以将每个孔中的培养基体积补足至180微升，并将板返回到培养箱中再15至20分钟。单击软件上的打开托盘以打开海马的热托盘。校准结束后，用含有细胞的测定微孔板替换实用板，然后按称重传感器板开始测量。

测量结束后，在不干扰细胞的情况下从平板中取出测定培养基，并用250微升磷酸盐缓冲盐水轻轻洗涤它们而不会使细胞脱落。现在向每个孔中加入10微升的放射性免疫沉淀裂解缓冲液，补充1X蛋白酶抑制剂鸡尾酒，并在摇摇杯上搅拌平板10分钟。将整个板在零下80摄氏度冷冻。

解冻板并按照制造商的说明进行蛋白质测量测定以进行数据归一化。通过使用Wave桌面软件打开数据文件来检索和分析数据。单击"规范化"，粘贴每个孔的规范化值，然后单击"应用"以规范化数据。

单击"导出"并选择"糖酵解压力测试报告生成器"，将分析的数据导出到报告生成器。非糖酵解酸化速率随着细胞数量的增加而上升，从50， 000增加到250， 000，但在200， 000到250， 000之间仅略有增加。注射10毫摩尔葡萄糖刺激所有细胞数量的糖酵解，在每孔250， 000个细胞时观察到ECAR的最大增加。

然而，注射两微摩尔寡霉素不会进一步增加ECAR。在同一组糖酵解胁迫试验中获得的OCR数据显示，由于复合物5抑制，寡霉素注射后显着下降。计算糖酵解胁迫试验参数，选择2微摩尔寡霉素中每孔250， 000个细胞进行进一步研究。

线粒体负荷试验表明，两次微摩尔寡霉素注射通过抑制复合物5引起OCR的显着降低。FCCP以剂量依赖性方式刺激HSPCs中的OCR，在两个微摩尔处观察到最大增加。0.5微摩尔鱼藤酮和0.5微摩尔抗霉素A注射液的混合物将OCR降低到与非线粒体耗氧量相对应的最小水平。

计算线粒体负荷试验参数，选取2微摩尔FCCP进行进一步研究。鉴于该技术的高通量性质，此处描述的方案可以很容易地适应于筛选造血干细胞，造血祖细胞和恶性造血细胞中的大量生物能量调节剂。海马分析在文献中被广泛用于在各种底物和抑制剂存在下测量各种情况下的新陈代谢。