造血幹細胞および前駆細胞の代謝変化は、血液形成の要求を維持するために静止状態から分化状態に移行することを可能にする。造血幹細胞や前駆細胞の代謝可塑性の変化は、血液疾患につながります。私たちのプロトコルは、血液の発達と病気の間に代謝調節と造血幹細胞および前駆細胞の健康を測定するのに役立ちます。
造血幹細胞や前駆細胞のミトコンドリア呼吸と解糖の解析は、脆弱で稀な集団であるため困難です。当社の最適化されたプロトコルにより、マウス骨髄からより多くの造血幹細胞および前駆細胞を単離し、インキュベーション中の生存率を向上させ、非接着性HSpcsの細胞外フラックス分析を促進し、酸化リン酸化と解糖経路を標的とする薬物に最適化された注射パラメータを提供します。この手順を開始するには、ユーティリティプレートの井戸とウェルの周りの部屋に無菌水を充填します。
センサーカートリッジをユーティリティプレートに差し込み、センサーが完全に水で覆われていることを確認します。その後、カートリッジを非CO2インキュベーターの37°Cでユーティリティプレートに沈め、一晩インキュベートします。クラスIIバイオセーフティキャビネットでは、アッセイプレートの各ウェルに市販の0.1%PLL溶液を40マイクロリットル加えます。
キットに用意されている蓋でアッセイプレートを覆い、ボンネット下の室温で閉じたプレートを1時間インキュベートします。この後、無菌真空系アスピレーターを使用して余分な溶液を除去し、ボンネットの下でプレートを乾燥させます。単核マウス骨髄細胞を収穫するには、密度勾配培地を5ミリリットルの円錐チューブに加える。
ゆっくりと5ミリリットルの骨髄細胞懸濁液を加え、細胞が密度勾配培地の上の層として残っていることを確認します。500倍gの遠心分離機と室温で30分間、遠心分離機が可能な限り低い加速度であることを確認します。単核細胞の中間界面を新鮮な15ミリリットルのチューブに収穫する。
その後、2%FBSを含む1X PBSの5ミリリットルで細胞を洗浄します。500倍gで遠心分離機、摂氏4度で5分間。上清を取り除き、2%FBSを含む1X PBSの300マイクロリットルで細胞を再懸濁します。
次に、FACSチューブ内の染色されていないまたは単色のコントロールのための細胞懸濁液のアリコート10マイクロリットル。単核マウス骨髄細胞からLSK HSPCsを収穫するには、15マイクロリットルのビオチン抗体カクテルを100マイクロリットルの単核骨髄細胞に加える。単核マウス骨髄細胞からLSK HSPCsを収穫するには、15マイクロリットルのビオチン抗体カクテルを100マイクロリットルの単核骨髄細胞に加える。
冷蔵庫のシェーカーに置いたアイスバケツにチューブを入れ、30分間攪拌して摂氏4度でインキュベートします。その後、細胞に2%FBSを含む1X PBSの10ミリリットルを加えます。500倍gで遠心分離機、摂氏4度で5分間。
上清を捨て、2%FBSを含む1X PBSの400マイクロリットルで細胞ペレットを再懸濁する。使用前に抗ビオチンマイクロビーズを簡単に渦を起たむ。各サンプルにマイクロビーズの80マイクロリットルを加え、よく混ぜます。
攪拌で摂氏4度でさらに20分間インキュベートします。この後、細胞に2%FBSを含む10ミリリットルの冷蔵PBSを加えます。チューブを500倍g、摂氏4度で5分間遠心します。
上清を捨て、2%FBSを含むPBSの1ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁する。磁気分離装置を設置しながら、セルサスペンションを摂氏4度で保存します。磁気アシストセルソートセパレータの磁場にカラムを摂氏4度で配置します。
2%FBSを含む1X PBSの3ミリリットルを摂氏4度で重力流でリンスして、磁気分離のためのカラムを準備します。セルサスペンションを4°Cのプレウェットカラムに加えます。すべての細胞が摂氏4度でカラムを通過し、15ミリリットルの円錐管に排水を集めます。
次に、1X PBSの3ミリリットルと摂氏4度で2%FBSでカラムを洗います。この洗浄を3回繰り返します。流れを収集し、摂氏4度に保ちます。
500倍gで流れを含む円錐管を5分間摂氏4度で遠心分離する。上清を捨て、2%FBSで1X PBSの0.5ミリリットルで細胞を再懸濁し、FACSチューブに懸濁液を移します。その後、各1000万個の細胞にLSK抗体カクテルの24マイクロリットルを加えます。
ホイルでチューブを覆い、1時間攪拌で摂氏4度で暗闇の中でインキュベートします。この後、FACSチューブに2%FBSの1X PBSを3ミリリットル加えます。500倍gで遠心分離機、摂氏4度で5分間。
上清を捨て、2%FBSを含む1X PBSの1ミリリットルで抗体標識細胞を再懸濁する。仕分け直前に、1ミリリットルのヨウ化プロピジウム1ミリグラムを1マイクロリットルを細胞懸濁液に加え、40マイクロメートルのストレーナーを使用してFACSチューブの内容物をフィルタリングします。まず、収集したLSK細胞を500倍gで、室温で5分間遠心する。
上清を捨て、完全な培地中の細胞を40マイクロリットル当たり少なくとも70,000個の細胞の最終濃度まで再懸濁する。この細胞懸濁液の種子40マイクロリットルは、PLLコーティングされた8ウェルプレートの井戸に入り、すべてのコーナーウェルを空のままにします。プレートを450倍g、室温で1分間遠心します。
逆顕微鏡を使用して、細胞がウェルの底に取り付けられていることを確認します。この後、各ウェルの細胞に完全な培地の135マイクロリットルを加え、各ウェルの最終体積を175マイクロリットルにします。プレートの2つのコーナーに175マイクロリットルの完全なメディアをブランクとして追加します。
37°Cで非CO2インキュベーターに細胞を2時間インキュベートします。次に、テキストプロトコルの表2と表3に概説されているように、プレートの各ウェルに薬物を追加するアナライザー用のプログラムを設定します。ミトコンドリア応力試験では、各ウェルが2つのマイクロモルオリゴマイシン、1.5マイクロモルFCCP、および必要に応じてロテロンと抗ミシンAの0.5マイクロモルの最終濃度を有するように、インキュベーターからユーティリティプレート内のセンサーカートリッジを取り出します。
センサーカートリッジから蓋を取り出し、計器トレイに置きます。20分かかるキャリブレーションプロセスを開始します。キャリブレーションが完了したら、ユーティリティプレートを取り外し、LSK細胞を含むアッセイプレートに置き換えます。
前に設定したプログラムを開始するには、続行を押します。プログラムが完了したら、データを取得して分析します。本研究では、生存可能なマウスLSK HSPの最大量を単離し、その解糖およびミトコンドリア代謝を細胞外フラックス分析装置で測定した。
細胞外フラックス解析は従来、接着細胞に使用されていますが、この方法では、LSK HSPCsをPLLコーティングされたウェルに接着させ、細胞外フラックスの測定とLSK HSPCsの代謝の健康を可能にします。基底およびストレス条件下での細胞外酸性化率を介した酸素消費率と解糖によるミトコンドリア呼吸を測定するために、解糖およびミトコンドリア呼吸を妨害する薬剤を順次注入する。予想通り、細胞外酸性化率の基底レベルは、負の培地で培養されたものと比較してグルコースおよびピルビン酸陽性培地で培養されたLSK HSPCsに対して高い。
グルコースによる注射は、陽性培地で培養された細胞の細胞外酸性化速度を変化させなかったが、陰性培地中の細胞の解糖を高めた。しかし、これらの細胞の基底レベルは依然として陽性群において低いままであった。オリゴマイシンによる注射は、陽性群の最大レベルで解糖を活性化したが、陰性基には影響しなかった。
2-DGでグルコースアナログを用いた注入は、非解糖レベルに細胞外酸性化率を戻した。ミトコンドリアストレス試験では、オリゴマイシンの注入により、ミトコンドリア膜がETC複合体を通るプロトンのポンピングを防止し、ミトコンドリア呼吸の速度を低下させる。FCCPの注入は細胞がミトコンドリア膜電位を回復しようとするので酸素消費率を最大限に押し出す。
他の2つの電子輸送鎖阻害剤による注入は、ミトコンドリア呼吸を完全に停止させ、酸素消費率を最小レベルに戻す原因となる。単核細胞分離のために赤い細胞のリシスバッファーを使用しないでください。束の形成を防ぎ、LSKの損失を減らすために、Ficoll勾配分離をお勧めします。
最適化された方法を用いて、希少で壊れやすい造血幹細胞および前駆細胞のミトコンドリア呼吸と解糖を測定し、代謝キューの研究は正常および悪性造血を調節することができます。
