Durante l'ematopoiesi, le cellule staminali ematopoietiche subiscono un passaggio metabolico dalla glicolisi alla fosforilazione ossidativa. Questo protocollo può essere utilizzato per valutare le funzioni glicolitiche e mitocondriali delle cellule staminali ematopoietiche del topo e delle cellule progenitrici. Questo metodo può essere utilizzato per valutare la bioenergetica cellulare in tempo reale.
La piattaforma basata su micropiastre a 96 pozzetti offre una quantificazione ad alta produttività con elevata sensibilità, consentendo l'analisi simultanea di più campioni utilizzando una singola piastra. Questa tecnica può essere utilizzata per sondare gli effetti di sostanze chimiche o manipolazioni genetiche sul metabolismo HSC in varie condizioni. Può aiutare a chiarire le vie metaboliche che sostengono la pluripotenza HSC.
Sebbene l'attuale studio si concentri principalmente su staminali ematopoietiche di topo e cellule progenitrici, il protocollo e questo approccio potrebbero essere facilmente adattati per ottimizzare le condizioni di analisi per qualsiasi tipo di cellule in sospensione. Un giorno prima del test, aprire il kit di analisi del flusso extracellulare per rimuovere la cartuccia del sensore e il gruppo della piastra di utilità. Salvare i piani guida di carico per utilizzarli il giorno successivo.
Ora separa manualmente la cartuccia del sensore dalla piastra dell'utilità e posizionala a testa in giù accanto alla piastra dell'utilità. Utilizzando una pipetta multicanale, riempire ogni pozzetto della piastra di utilità con 200 microlitri di calibrante inclusi nel kit di analisi del flusso, quindi riposizionare la cartuccia del sensore sulla piastra di utilità, assicurandosi di immergere completamente i sensori nel calibrante. Quindi incubare la piastra di utilità con calibrante e cartuccia sensore assemblata in un incubatore di anidride carbonica a 37 gradi Celsius durante la notte seguendo le condizioni di umidificazione menzionate nel manoscritto.
Il giorno del test, preparare 2,5 millilitri della soluzione adesiva cellulare per micropiastra di coltura cellulare a 96 pozzetti come descritto nel manoscritto di testo. Aprire la micropiastra di coltura cellulare a 96 pozzetti inclusa nel kit di analisi del flusso ed erogare 25 microlitri della soluzione adesiva cellulare preparata sul fondo di ciascun pozzetto. Coprire la micropiastra con il coperchio e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente all'interno della cappa.
Dopo l'incubazione, rimuovere e scartare la soluzione adesiva cellulare in eccesso utilizzando una pipetta multicanale o un aspiratore e lavare ogni pozzetto due volte con 200 microlitri di acqua ultrapura sterile. Asciugare all'aria la piastra senza il coperchio all'interno del cappuccio per 30-45 minuti. Centrifugare gli HSPC negativi del lignaggio del topo preparati a 200 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente.
Dopo aver scartato il surnatante, risospesere il pellet cellulare nel mezzo di saggio appropriato e nuovamente centrifugare la sospensione cellulare. Ripetere questa procedura ancora una volta e risospese le cellule nel mezzo di saggio riscaldato appropriato alla concentrazione di 250.000 cellule per 50 microlitri o cinque milioni di cellule per millilitri. Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 50 microlitri della sospensione cellulare lungo il lato di ciascun pozzetto della micropiastra di coltura cellulare a 96 pozzetti rivestita con adesivo cellulare, quindi aggiungere 50 microlitri del mezzo di saggio nei pozzetti di misurazione di fondo angolari.
Creare una piastra di bilanciamento centrifuga aggiungendo 50 microlitri di acqua per pozzetto di una micropiastra di coltura cellulare a 96 pozzetti non rivestita. Centrifugare le celle a 200 volte G per un minuto a temperatura ambiente. Incubare la piastra in un incubatore non di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per 25-30 minuti per l'attacco cellulare.
Dopo 30 minuti, confermare visivamente al microscopio che le cellule sono stabilmente aderenti alla superficie della micropiastra. Iniziare preparando tutte le soluzioni necessarie nel mezzo di analisi del test di stress di glicolisi preriscaldato come menzionato nel manoscritto di testo e rimuovere la cartuccia del sensore idrato dall'incubatore. Sollevare la cartuccia del sensore dal calibrante e sostituirla sulla stessa piastra di utilità con il calibrante per rimuovere le bolle d'aria.
Posizionare la guida di caricamento 80 piatta sulla parte superiore della cartuccia del sensore orientandola in modo che la lettera A si trovi nell'angolo in alto a sinistra. Utilizzando una pipetta multicanale, erogare 20 microlitri di soluzione di glucosio da 100 millimolari nella porta A.Sostituire la guida di carico piatta 80 con la guida di carico BC piatta, orientando la lettera B nell'angolo in alto a sinistra. Erogare 22 microlitri di 20 micromolari soluzione di oligomicina nella porta B.Riorientare la guida di carico BC piatta per individuare la lettera C nell'angolo in alto a sinistra per la porta di carico C ed erogare 25 microlitri di 500 millimolari soluzione 2-deossi-d-glucosio nella porta C.Quindi rimuovere e scartare i piatti della guida di carico.
Ora crea o carica il modello per il test di stress della glicolisi sul controller. Immettere i dettagli relativi alle strategie di iniezione, alle condizioni di trattamento e ai tipi di cellule e premere Genera gruppi. Vai alla mappa della piastra e assegna i pozzetti a ciascun gruppo da analizzare.
Nel protocollo, assicurarsi che la calibrazione e l'equilibrio siano controllati nella fase di inizializzazione. Per la misurazione e le misurazioni di base dopo ogni iniezione, impostare il numero di cicli di misurazione su tre e mescolare, attendere, misurare i tempi a tre minuti, zero minuti, tre minuti. Fare clic su Avvia esecuzione sul software.
Rimuovere il coperchio dalla cartuccia del sensore caricata e idratata e posizionarla sul vassoio di lavoro dell'analizzatore di flusso extracellulare. Iniziare l'esecuzione della calibrazione. Estrarre la micropiastra contenente le cellule seminate dall'incubatrice.
Senza disturbare le cellule, aggiungere lentamente 130 microlitri del mezzo di prova della glicolisi preriscaldato per pozzetto per comporre il volume medio in ciascun pozzetto a 180 microlitri e restituire la piastra all'incubatore per altri 15-20 minuti. Fare clic su Apri vassoio sul software per aprire il vassoio termico di Seahorse. Al termine della calibrazione, sostituire la piastra di utilità con questa micropiastra di analisi contenente le celle e premere la piastra della cella di carico per avviare le misurazioni.
Al termine delle misurazioni, rimuovere il mezzo di saggio dalla piastra senza disturbare le cellule e lavarle delicatamente con 250 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato senza spostare le cellule. Ora aggiungi 10 microlitri di tampone di lisi di radioimmunoprecipitazione integrato con 1X cocktail inibitore della proteasi a ciascun pozzetto e agita la piastra su uno shaker per 10 minuti. Congelare l'intera piastra a meno 80 gradi Celsius.
Scongelare la piastra ed eseguire un test di misurazione delle proteine per la normalizzazione dei dati seguendo le istruzioni del produttore. Recupera e analizza i dati aprendo il file di dati utilizzando il software desktop Wave. Fare clic su Normalizza, incollare i valori di normalizzazione per ciascun pozzetto e quindi fare clic su Applica per normalizzare i dati.
Fare clic su Esporta e selezionare il generatore di report di stress test di glicolisi per esportare i dati analizzati in un generatore di report. Il tasso di acidificazione non glicolitica aumenta con l'aumento del numero di cellule da 50.000 a 250.000, ma aumenta solo in minima parte tra 200.000 e 250.000. L'iniezione di glucosio 10 millimolare stimola la glicolisi a tutti i numeri di cellule con un aumento massimo di ECAR osservato a 250.000 cellule per pozzetto.
Tuttavia, l'iniezione di due micromolari di oligomicina non aumenta ulteriormente l'ECAR. I dati OCR ottenuti nella stessa serie di test di stress della glicolisi mostrano un calo significativo dopo l'iniezione di oligomicina a causa dell'inibizione del complesso 5. Sono stati calcolati i parametri del test di stress della glicolisi e sono state selezionate 250.000 cellule per pozzetto in due micromolari di oligomicina per ulteriori studi.
Lo stress test mitocondriale ha dimostrato che l'iniezione di oligomicina micromolare provoca una significativa riduzione dell'OCR attraverso l'inibizione del complesso 5. FCCP stimola l'OCR negli HSPC in modo dose-dipendente con un aumento massimo osservato a due micromolari. Una miscela di 0,5 micromolari rotenone e 0,5 micromolari antimicina A iniezione riduce l'OCR al suo livello minimo corrispondente al consumo di ossigeno non mitocondriale.
Sono stati calcolati i parametri della prova di stress mitocondriale e due micromolari di FCCP sono stati selezionati per ulteriori studi. Data la natura ad alto rendimento di questa tecnica, il protocollo qui descritto potrebbe essere facilmente adattato per lo screening di un gran numero di modulatori bioenergetici in cellule staminali ematopoietiche, progenitori ematopoietici e cellule ematopoietiche maligne. L'analisi del cavalluccio marino è ampiamente utilizzata in letteratura per misurare il metabolismo in un'ampia varietà di contesti in presenza di vari substrati e inibitori.
