Au cours de l’hématopoïèse, les cellules souches hématopoïétiques subissent un passage métabolique de la glycolyse à la phosphorylation oxydative. Ce protocole peut être utilisé pour évaluer les fonctions glycolytiques et mitochondriales des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques de souris. Cette méthode peut être utilisée pour évaluer la bioénergétique cellulaire en temps réel.
La plate-forme à base de microplaques de 96 puits offre une quantification à haut débit avec une sensibilité élevée, permettant l’analyse simultanée de plusieurs échantillons à l’aide d’une seule plaque. Cette technique peut être utilisée pour sonder les effets de produits chimiques ou de manipulations génétiques sur le métabolisme des CSH dans des conditions variées. Il peut aider à élucider les voies métaboliques qui soutiennent la pluripotence HSC.
Bien que la présente étude soit principalement axée sur les souches hématopoïétiques de souris et les cellules progénitrices, le protocole et cette approche pourraient facilement être adaptés pour optimiser les conditions d’analyse pour tout type de cellules en suspension. Un jour avant le test, ouvrez le kit de dosage de flux extracellulaire pour retirer la cartouche de capteur et l’ensemble de plaques utilitaires. Enregistrez les plats du guide de chargement pour les utiliser le lendemain.
Maintenant, séparez manuellement la cartouche de capteur de la plaque utilitaire et placez-la à l’envers à côté de la plaque utilitaire. À l’aide d’une pipette multicanal, remplissez chaque puits de la plaque utilitaire avec 200 microlitres d’étriquant inclus avec le kit de dosage de flux, puis replacez la cartouche de capteur sur la plaque utilitaire, en veillant à immerger complètement les capteurs dans l’étrier. Ensuite, incubez la plaque utilitaire avec de l’étrier et une cartouche de capteur assemblée dans un incubateur sans dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant la nuit après les conditions d’humidification mentionnées dans le manuscrit.
Le jour de l’essai, préparez 2,5 millilitres de la solution adhésive cellulaire par microplaque de culture cellulaire de 96 puits, comme décrit dans le manuscrit textuel. Ouvrez la microplaque de culture cellulaire à 96 puits incluse avec le kit de dosage de flux et distribuez 25 microlitres de la solution adhésive cellulaire préparée au fond de chaque puits. Couvrir la microplaque avec le couvercle et incuber pendant 30 minutes à température ambiante à l’intérieur de la hotte.
Après l’incubation, retirez et jetez l’excès de solution adhésive cellulaire à l’aide d’une pipette ou d’un aspirateur multicanal et lavez chaque puits deux fois avec 200 microlitres d’eau ultrapure stérile. Sécher à l’air libre la plaque sans le couvercle à l’intérieur de la hotte pendant 30 à 45 minutes. Centrifugez les HSPC négatifs de la lignée de souris préparée à 200 fois G pendant cinq minutes à température ambiante.
Après avoir éliminé le surnageant, remettre en suspension la pastille de cellule dans le milieu d’essai approprié et centrifuger à nouveau la suspension cellulaire. Répétez cette procédure une fois de plus et remettez en suspension les cellules dans le milieu d’essai réchauffé approprié à la concentration de 250 000 cellules par 50 microlitres ou cinq millions de cellules par millilitre. Utilisez une pipette multicanal pour ajouter 50 microlitres de la suspension cellulaire le long du côté de chaque puits de la microplaque de culture cellulaire de 96 puits revêtue d’adhésif cellulaire, puis ajoutez 50 microlitres du milieu d’essai dans les puits de mesure de fond d’angle.
Créez une plaque d’équilibre de centrifugeuse en ajoutant 50 microlitres d’eau par puits d’une microplaque de culture cellulaire non revêtue de 96 puits. Centrifugez les cellules à 200 fois G pendant une minute à température ambiante. Incuber la plaque dans un incubateur sans dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant 25 à 30 minutes pour la fixation cellulaire.
Après 30 minutes, confirmez visuellement au microscope que les cellules adhèrent de manière stable à la surface de la microplaque. Commencez par préparer toutes les solutions requises dans le milieu de test de stress de glycolyse préchauffé comme mentionné dans le manuscrit du texte et retirez la cartouche de capteur hydratée de l’incubateur. Retirez la cartouche du capteur de l’étrier et remplacez-la sur la même plaque utilitaire par l’étrier pour éliminer les bulles d’air.
Placez le guide de chargement 80 à plat sur le dessus de la cartouche du capteur en l’orientant de manière à ce que la lettre A soit située dans le coin supérieur gauche. À l’aide d’une pipette multicanal, distribuer 20 microlitres de solution de glucose de 100 millimolaires dans le port A.Remplacez le guide de chargement 80 à plat par le guide de chargement BC à plat, en orientant la lettre B dans le coin supérieur gauche. Distribuer 22 microlitres de 20 micromolaires solution d’oligomycine dans le port B.Réorienter le guide de chargement BC à plat pour localiser la lettre C dans le coin supérieur gauche du port de chargement C et distribuer 25 microlitres de solution de 2-désoxy-d-glucose de 500 millimolaires dans le port C.Ensuite, retirez et jetez les plats du guide de chargement.
Maintenant, créez ou chargez le modèle pour le test de stress de glycolyse sur le contrôleur. Entrez les détails concernant les stratégies d’injection, les conditions de traitement et les types de cellules, puis appuyez sur Générer des groupes. Allez sur la carte des plaques et attribuez des puits à chaque groupe à analyser.
Dans le protocole, assurez-vous que l’étalonnage et l’équilibrage sont vérifiés à l’étape d’initialisation. Pour la mesure de base et les mesures après chaque injection, réglez le nombre de cycles de mesure sur trois et mélangez, attendez, mesurez les temps à trois minutes, zéro minute, trois minutes. Cliquez sur Démarrer l’exécution sur le logiciel.
Retirez le couvercle de la cartouche de capteur chargée et hydratée et placez-le sur le plateau de travail de l’analyseur de flux extracellulaire. Commencez l’exécution de l’étalonnage. Retirez la microplaque contenant les cellules ensemencées de l’incubateur.
Sans perturber les cellules, ajoutez lentement 130 microlitres du milieu de test de stress de glycolyse préchauffé par puits pour augmenter le volume moyen dans chaque puits à 180 microlitres et retournez la plaque à l’incubateur pendant 15 à 20 minutes supplémentaires. Cliquez sur Ouvrir le plateau sur le logiciel pour ouvrir le plateau thermique de Seahorse. Une fois l’étalonnage terminé, remplacez la plaque utilitaire par cette microplaque de dosage contenant les cellules et appuyez sur la plaque de cellule de charge pour démarrer les mesures.
Une fois les mesures terminées, retirez le milieu d’essai de la plaque sans perturber les cellules et lavez-les doucement avec 250 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate sans déloger les cellules. Maintenant, ajoutez 10 microlitres de tampon de lyse de radioimmunoprécipitation complété par un cocktail d’inhibiteurs de protéase 1X à chaque puits et agitez la plaque sur un shaker pendant 10 minutes. Congeler toute la plaque à moins 80 degrés Celsius.
Décongelez la plaque et effectuez un test de mesure des protéines pour la normalisation des données en suivant les instructions du fabricant. Récupérez et analysez les données en ouvrant le fichier de données à l’aide du logiciel de bureau Wave. Cliquez sur Normaliser, collez les valeurs de normalisation pour chaque puits, puis cliquez sur Appliquer pour normaliser les données.
Cliquez sur Exporter et sélectionnez générateur de rapports de test de stress de glycolyse pour exporter les données analysées vers un générateur de rapports. Le taux d’acidification non glycolytique augmente avec l’augmentation du nombre de cellules de 50 000 à 250 000, mais n’augmente que très peu entre 200 000 et 250 000. L’injection de glucose de 10 millimolaires stimule la glycolyse à tous les nombres de cellules avec une augmentation maximale de l’ECAR observée à 250 000 cellules par puits.
Cependant, l’injection de deux micromolaires d’oligomycine n’augmente pas davantage l’ECAR. Les données OCR obtenues dans le même ensemble de tests de stress de glycolyse montrent une baisse significative après l’injection d’oligomycine en raison de l’inhibition du complexe 5. Les paramètres du test d’effort de glycolyse ont été calculés et 250 000 cellules par puits dans deux micromolaires d’oligomycine ont été sélectionnées pour d’autres études.
Le test de stress mitochondrial a montré que deux injections micromolaires d’oligomycine provoquent une réduction significative de l’OCR via l’inhibition du complexe 5. Le FCCP stimule l’OCR dans les HSPC de manière dose-dépendante avec une augmentation maximale observée à deux micromolaires. Un mélange de 0,5 roténone micromolaire et de 0,5 injection d’antimycine A micromolaire diminue l’OCR à son niveau minimal correspondant à la consommation d’oxygène non mitochondrial.
Les paramètres du test de stress mitochondrial ont été calculés et deux micromolaires de FCCP ont été sélectionnés pour d’autres études. Compte tenu de la nature à haut débit de cette technique, le protocole décrit ici pourrait facilement être adapté pour dépister un grand nombre de modulateurs bioénergétiques dans les cellules souches hématopoïétiques, les progéniteurs hématopoïétiques et les cellules hématopoïétiques malignes. L’analyse des hippocampes est largement utilisée dans la littérature pour mesurer le métabolisme dans une grande variété de contextes en présence de divers substrats et inhibiteurs.
