血管では、内皮細胞の数が非常に少ないため、それらを研究することは困難になります。私たちのプロトコルはこの制限を排除し、新しい分子経路と治療法を研究することを可能にします。私たちのプロトコルにより、内皮濃縮サンプルを取得し、急性および慢性の乱れがこの細胞型にどのように影響するかを研究できます。
内皮細胞をより詳細に研究する能力は、標的遺伝子を定義することを可能にし、したがって内皮細胞を標的とするアテローム性動脈硬化症の潜在的な治療法を可能にする。頸動脈の隔離はトリッキーであり、忍耐と経験が必要です。はじめに、1キログラムあたり0.05ミリグラムのブプレノルフィンを皮下注射することによって動物を準備します。
ベタジンとイソプロパノール溶液を使用して脱毛領域を3回滅菌します。首の領域で約1センチメートルの腹側正中線切開を行います。次に、LCA分岐点を鈍的解剖によって公開します。
左内頸動脈、外頸動脈、後頭動脈を6-0縫合糸で結睦し、上甲状腺動脈はそのままにします。組織接着剤または縫合糸で切開を閉じます。摂氏37度に保たれた予熱した回復ケージにマウスを移します。
術後の低体温を避けるために、マウスを清潔なタオルの上に最大1時間置きます。心臓の頂点を介して左心室に接続されたIVラインに21ゲージの針を挿入します。室温で通常の生理食塩水を使用して2〜3分間逆行性灌流させます。.
IVラインを注入または使用しながら安定した圧力をかけ、生理食塩水バッグを8〜9フィートの高さに保つことにより、一定の流量を維持します。頸動脈を露出させるために、すべての脂肪、筋肉、結合組織で首の領域から皮膚を取り除きます。次に、頸動脈の周りの外膜組織を取り除き、頸動脈を体に付着させます。
LCAの結紮部位の下に切開を行い、灌流を可能にします。左心室を通してLCAをさらに1分間灌流して、血液の痕跡を取り除きます。頸動脈の外側を通常の生理食塩水で洗い、微量の血液を取り除きます。
29ゲージの針を備えたインスリン注射器を使用して、左頸動脈の遠位端の内腔に50マイクロリットルの消化バッファーを注入します。マイクロクリップを使用して、消化バッファーで満たされた頸動脈の近位端をクランプします。15〜20マイクロリットルの消化バッファーを内腔に加え、消化バッファーの放出を避けるために遠位端をクリップします。
マウスの頸動脈を、温かい摂氏37度のHEPES緩衝生理食塩水を含む35ミリメートルの皿に移します。そして断続的に揺れながら摂氏37度で45分間それらをインキュベートします。管腔酵素消化が完了した後、35ミリメートル皿からクランプで頸動脈を取り外します。
消化バッファーが漏れないように、クランプを慎重に取り外します。頸動脈の一端を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブの上に保持します。インスリン注射器を備えた29ゲージの針を挿入することにより、100マイクロリットルの温かい消化バッファーを内腔に追加します。
マイクロ遠心チューブ内の頸動脈の内腔をすばやく洗い流し、0.3マイクロリットルのFBSをチューブに加えて反応を停止します。マイクロ遠心チューブを氷の上に置きます。固定角ローターを備えた遠心分離機を使用して、細胞を摂氏4度で500Gで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
細胞解離試薬を含む消化バッファーに細胞を再懸濁し、摂氏37度で5分間インキュベートして単一細胞に分離します。0.5ミリリットルのチューブに0.15ミリリットルのFBSを加えて酵素反応をブロックし、遠心分離を繰り返します。上清を廃棄し、0.2ミリリットルのマイクロ遠心チューブ内のPBS中の100マイクロリットルの氷冷1%BSA溶液に細胞を再懸濁します。
シングルセル解析の場合は、ペレットを100マイクロリットルの氷冷1%BSAでPBSに0.2ミリリットルのチューブに再懸濁します。単核分析では、細胞ペレットを氷冷PBS中の0.04%BSAの100マイクロリットルに再懸濁し、単一細胞懸濁液を摂氏4度で5分間500Gで遠心分離します。単一細胞懸濁液を氷冷溶解バッファーで分解し、氷上で5分間インキュベートします。
ライセートをP20ピペットと混合し、さらに10分間インキュベートします。その後、ライセートを0.5ミリリットルのチューブに移します。ly細胞を500マイクロリットルのバッファーで洗浄し、ピペットを使用して混合します。
その後、遠心分離を繰り返します。上清を捨て、核ペレットを150マイクロリットルの希釈核緩衝液に再懸濁した。血球計算盤を使用して単一核製剤を数えます。
単一核シーケンシング研究に続いて、単一細胞および単一核が得られ、明視野顕微鏡および位相差顕微鏡によって視覚化されました。単一細胞懸濁液からの単一核調製の効率も実証された。シングルセルRNAシーケンシング研究の後、細胞あたりの遺伝子の分布、細胞あたりの一意の分子識別子、細胞あたりのミトコンドリアリード、シーケンシング飽和データなどのさまざまなパラメーターが得られました。
シングルセルATAC配列研究のために、ヌクレオソームバンディングパターンを含むインサートサイズ分布は観察されなかった。正規化されたTSS濃縮スコアも観察された。さらに、パーセントフラグメントはピークで読み取ります。
ピーク領域断片、TSS濃縮スコア、ブラックリストゲノムサイトにおけるリードの比率、およびヌクレオソームシグナル比を決定した。酵素消化は細胞にとってストレスであるため、サンプルを氷上に維持し、できるだけ早く手順を実行することが重要です。この方法を使用して、マウスから内皮細胞を取得し、プレート化することができます。
この手法を使用して、バルクOmixベースの研究を実行することもできます。この技術は、生体内の内皮細胞に対する血流障害の影響を単一細胞様式で研究するための道を開いた。
