혈관에서는 내피 세포의 수가 매우 적어 연구하기가 어렵습니다. 우리의 프로토콜은 이러한 한계를 제거하고 새로운 분자 경로와 치료법을 연구 할 수있게합니다. 우리의 프로토콜을 통해 내피가 풍부한 샘플을 얻고 급성 및 만성 교란 흐름이이 세포 유형에 어떤 영향을 미치는지 연구 할 수 있습니다.
내피 세포를보다 자세히 연구 할 수있는 능력은 표적 유전자를 정의 할 수있게하고, 따라서 내피 세포를 표적으로하는 죽상 동맥 경화증에 대한 잠재적 인 치료제를 정의 할 수 있습니다. 경동맥 격리는 까다 롭고 인내와 경험이 필요합니다. 시작하려면 부 프레 노르 핀 킬로그램 당 0.05 밀리그램을 피하에 주사하여 동물을 준비하십시오.
Betadine과 이소프로판올 용액을 사용하여 제모 된 부위를 3 회 멸균하십시오. 목 부위에서 약 1cm의 복부 정중선 절개를하십시오. 그런 다음 무딘 해부로 LCA 분기점을 노출시킵니다.
왼쪽 내경동맥, 외경동맥 및 후두동맥을 6-0 봉합사로 결찰하여 상갑상선 동맥을 그대로 둡니다. 조직 접착제 또는 봉합사로 절개를 닫으십시오. 마우스를 섭씨 37도로 유지되는 예열된 복구 케이지로 옮깁니다.
수술 후 저체온증을 피하기 위해 마우스를 깨끗한 수건에 최대 1시간 동안 두십시오. 심장의 정점을 통해 좌심실로 연결된 IV 라인에 21 게이지 바늘을 삽입합니다. 실온에서 일반 식염수를 사용하여 2-3분 동안 역행 관류를 허용합니다.
IV 라인을 주입하거나 사용하는 동안 일정한 압력을 가하고 식염수 백을 8-9 피트 높이로 유지하여 일정한 유속을 유지하십시오. 모든 지방, 근육 및 결합 조직으로 목 부위의 피부를 제거하여 경동맥을 노출시킵니다. 그런 다음 경동맥 주위의 외막 주위 조직을 제거하여 경동맥이 몸에 붙어 있습니다.
관류를 허용하기 위해 LCA의 결찰 부위 아래에 절개를하십시오. 좌심실을 통해 LCA를 1 분 더 관류하여 혈액 흔적을 제거하십시오. 경동맥 외부를 일반 식염수로 씻어 혈액의 흔적을 제거하십시오.
29 게이지 바늘이있는 인슐린 주사기를 사용하여 50 마이크로 리터의 소화 완충액을 왼쪽 경동맥 말단부 내강에 주입하십시오. 마이크로 클립을 사용하여 소화 완충액으로 채워진 경동맥의 근위 끝을 고정하십시오. 15 내지 20 마이크로리터의 소화 완충액을 내강에 첨가하고, 소화 완충액의 방출을 피하기 위해 말단부를 클립한다.
마우스의 경동맥을 섭씨 37도의 따뜻한 hepes 완충 식염수가 들어 있는 35mm 접시로 옮깁니다. 그리고 간헐적 인 흔들림으로 섭씨 37도에서 45 분 동안 배양하십시오. 내강 효소 소화가 완료된 후 35mm 접시에서 클램프로 경동맥을 제거하십시오.
소화 완충액이 누출되지 않도록 클램프를 조심스럽게 분리하십시오. 경동맥의 한쪽 끝을 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브 위에 놓습니다. 인슐린 주사기가 장착 된 100 게이지 바늘을 삽입하여 29 마이크로 리터의 따뜻한 소화 완충액을 루멘에 첨가하십시오.
마이크로 원심 분리 튜브에서 경동맥 내강을 빠르게 세척 한 다음 0.3 마이크로 리터의 FBS를 튜브에 추가하여 반응을 중지합니다. 마이크로 원심 분리기 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 세포를 섭씨 4도에서 5분 동안 500G에서 원심분리하고, 고정각 로터가 장착된 원심분리기를 사용하여 상층액을 버린다.
세포 해리 시약이 들어있는 소화 완충액에 세포를 다시 현탁시키고 섭씨 37도에서 5 분 동안 배양하여 단일 세포로 분리합니다. 0.5 밀리리터 튜브에 FBS 0.15 밀리리터를 첨가하여 효소 반응을 차단하고 원심분리를 반복한다. 상청액을 버리고 0.2 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브의 PBS 중 100 마이크로 리터의 얼음처럼 차가운 1 % BSA 용액에 세포를 재현 탁시킵니다.
단일 세포 분석을 위해 0.2 밀리리터 튜브의 PBS에 100 마이크로 리터의 얼음처럼 차가운 1 % BSA로 펠릿을 재현탁하십시오. 단일 핵 분석을 위해 얼음처럼 차가운 PBS에서 0.04% BSA의 100마이크로리터에 세포 펠릿을 재현탁하고 섭씨 4도에서 500G에서 5분 동안 단일 세포 현탁액을 원심분리합니다. 단일 세포 현탁액을 얼음 냉장 용해 완충액으로 분해하고, 얼음 상에서 5분 동안 배양한다.
용해물을 P20 피펫과 혼합하고 10분 더 배양합니다. 그 후, 용해물을 0.5 밀리리터 튜브로 옮깁니다. ly 세포를 500 마이크로리터의 완충액으로 세척하고, 피펫을 사용하여 혼합한다.
그런 다음 원심 분리를 반복하십시오. 상청액을 버리고, 희석된 핵 완충액의 150 마이크로리터에 핵 펠릿을 재현탁시킨다. 혈구계를 사용하여 단일 핵 제제를 세십시오.
단일 핵 시퀀싱 연구에 이어 명시야 및 위상차 현미경으로 단일 세포 및 단일 핵을 얻고 시각화했습니다. 단일 세포 현탁액으로부터 단일 핵 준비의 효율성이 또한 입증되었다. 단일 세포 RNA 시퀀싱 연구 후, 세포 당 유전자 분포, 세포 당 고유 한 분자 식별자, 세포 당 미토콘드리아 판독 및 시퀀싱 포화 데이터와 같은 다양한 매개 변수가 얻어졌습니다.
단일 세포 ATAC 서열 연구를 위해, 뉴클레오솜 밴딩 패턴을 포함한 삽입 크기 분포가 관찰되었다. 정규화된 TSS 농축 점수도 관찰되었다. 또한 백분율 조각은 피크에서 읽습니다.
피크 영역 단편, TSS 농축 점수, 블랙리스트 게놈 부위에서의 판독 비율, 및 뉴클레오솜 신호 비율을 결정하였다. 효소 소화는 세포에 대한 스트레스이므로 샘플을 얼음 위에 유지하고 가능한 한 빨리 절차를 수행하는 것이 중요합니다. 이 방법을 사용하여 마우스에서 내피 세포를 얻고 플레이트할 수 있습니다.
이 기술을 사용하여 대량 Omix 기반 연구를 수행 할 수도 있습니다. 이 기술은 단일 세포 방식으로 생체 내 내피 세포에 대한 교란 된 혈류의 영향을 연구하기위한 길을 열었습니다.
