En un vaso sanguíneo, el número de células endoteliales es muy bajo, lo que dificulta su estudio. Nuestro protocolo elimina esta limitación y nos permite estudiar nuevas vías moleculares y terapéuticas. Nuestro protocolo nos permite obtener muestras enriquecidas endotelialmente, y estudiar cómo el flujo perturbado agudo y crónico afecta a este tipo celular.
La capacidad de estudiar las células endoteliales con más detalle permite definir genes diana y, por lo tanto, terapias potenciales para la aterosclerosis dirigidas a las células endoteliales. El aislamiento de la arteria carótida es complicado y requiere paciencia y experiencia. Para comenzar, prepare al animal inyectando 0.05 miligramos por kilogramo de buprenorfina por vía subcutánea.
Esterilice el área depilada usando Betadine e isopropanol solución tres veces. Haga una incisión ventral en la línea media de aproximadamente un centímetro en la región del cuello. Luego exponga el punto de bifurcación LCA mediante disección roma.
Ligate la carótida interna izquierda, la carótida externa y las arterias occipitales con suturas 6-0, dejando intacta la arteria tiroidea superior. Cierre la incisión con pegamento de tejido o suturas. Transfiera el ratón a una jaula de recuperación precalentada mantenida a 37 grados centígrados.
Coloque el ratón sobre una toalla limpia durante un máximo de una hora para evitar la hipotermia postoperatoria. Inserte una aguja de calibre 21 en la línea IV conectada a través del ápice del corazón hacia el ventrículo izquierdo. Permita la perfusión retrógrada durante dos o tres minutos usando solución salina normal a temperatura ambiente.
Mantenga un caudal constante aplicando una presión constante mientras inyecta o usa una línea IV, y mantenga la bolsa salina a una altura de ocho a nueve pies. Retire la piel de la región del cuello con toda la grasa, los músculos y los tejidos conectivos para exponer las arterias carótidas. Luego retire los tejidos periadventicios alrededor de las carótidas dejando la carótida unida al cuerpo.
Haga una incisión debajo del sitio de ligadura en el LCA para permitir la perfusión. Perfunda el LCA a través del ventrículo izquierdo durante otro minuto para eliminar cualquier rastro de sangre. Lave el exterior de las arterias carótidas con solución salina normal para eliminar cualquier rastro de sangre.
Use una jeringa de insulina con una aguja de calibre 29 para inyectar 50 microlitros de tampón de digestión en el lumen del extremo distal de la arteria carótida izquierda. Use un microclip para sujetar el extremo proximal de la arteria carótida lleno de tampón de digestión. Agregue de 15 a 20 microlitros de tampón de digestión en el lumen y recorte el extremo distal para evitar cualquier liberación de tampón de digestión.
Transfiera las arterias carótidas del ratón a platos de 35 milímetros que contengan solución salina tamponada HEPES tibia de 37 grados centígrados. E incubarlos durante 45 minutos a 37 grados centígrados con balanceo intermitente. Retire la arteria carótida con las pinzas del plato de 35 milímetros después de que se complete la digestión enzimática luminal.
Separe las abrazaderas con cuidado, para que el amortiguador de digestión no tenga fugas. Sostenga un extremo de la arteria carótida sobre un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Agregue 100 microlitros de tampón de digestión caliente a la luz insertando una aguja de calibre 29 equipada con una jeringa de insulina.
Enjuague rápidamente la luz de la arteria carótida en el tubo de microcentrífuga, luego agregue 0.3 microlitros de FBS en el tubo para detener la reacción. Coloque el tubo de microcentrífuga sobre hielo. Centrifugar las celdas a 500 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados, utilizando una centrífuga equipada con un rotor de ángulo fijo y desechar el sobrenadante.
Vuelva a suspender las células en un tampón de digestión, que contiene el reactivo de disociación celular, e incubarlas durante cinco minutos a 37 grados centígrados para separarlas en células individuales. Bloquee la reacción enzimática agregando 0.15 mililitros de FBS al tubo de 0.5 mililitros y repita la centrifugación. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 100 microlitros de solución BSA al 1% helada en PBS en un tubo de microcentrífuga de 0,2 mililitros.
Para el análisis de una sola célula, resuspenda el pellet con 100 microlitros de BSA al 1% de hielo frío en PBS en un tubo de 0,2 mililitros. Para el análisis de un solo núcleo, resuspenda el pellet celular en 100 microlitros de 0.04% BSA en PBS helado y centrifugar la suspensión de una sola celda a 500G a cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Descomponga la suspensión de una sola célula con tampón de lisis helada e incube durante cinco minutos en hielo.
Mezclar el lisado con una pipeta P20 e incubar durante otros 10 minutos. Después, transfiera el lisado en un tubo de 0.5 mililitros. Lave las células con 500 microlitros de tampón y mézclelas con una pipeta.
Luego repita la centrifugación. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de núcleos en 150 microlitros del tampón de núcleos diluidos. Cuente las preparaciones de núcleos individuales usando un hemocitómetro.
Después del estudio de secuenciación de núcleos únicos, se obtuvieron y visualizaron núcleos únicos y de célula única mediante microscopía de campo claro y contraste de fase. También se demostró la eficiencia de la preparación de núcleos únicos a partir de la suspensión de una sola célula. Después del estudio de secuenciación de ARN de una sola célula, se obtuvieron varios parámetros como la distribución de genes por célula, el identificador molecular único por célula, las lecturas mitocondriales por célula y los datos de saturación de secuenciación.
Para el estudio de secuencia ATAC de una sola célula, se observó la distribución del tamaño del inserto, incluido el patrón de bandas de nucleosomas. También se observó la puntuación normalizada de enriquecimiento de TSS. Además, el fragmento de porcentaje se lee en los picos.
Se determinaron los fragmentos de la región máxima, la puntuación de enriquecimiento de TSS, la proporción de lecturas en los sitios genómicos de la lista negra y la relación de señal de los nucleosomas. La digestión enzimática es un estrés para las células, por lo tanto, es crucial mantener las muestras en hielo y realizar el procedimiento lo más rápido posible. Podemos usar este método para obtener y platear células endoteliales de ratones.
También podemos utilizar esta técnica para realizar estudios basados en Omix a granel. Esta técnica allanó el camino para estudiar el efecto del flujo sanguíneo alterado en las células endoteliales in vivo de una manera de una sola célula.
