Em um vaso sanguíneo, o número de células endoteliais é muito baixo, o que dificulta o estudo. Nosso protocolo elimina essa limitação e nos permite estudar novas vias moleculares e terapêuticas. Nosso protocolo nos permite obter amostras enriquecidas endoteliais e estudar como o fluxo perturbado agudo e crônico afeta esse tipo de célula.
A capacidade de estudar as células endoteliais em mais detalhes torna possível definir genes-alvo e, portanto, potenciais terapêuticas para a aterosclerose visando as células endoteliais. O isolamento da artéria carótida é complicado e requer paciência e experiência. Para começar, prepare o animal injetando 0,05 miligramas por quilograma de buprenorfina por via subcutânea.
Esterilizar a área depilada usando Betadine e solução de isopropanol três vezes. Faça uma incisão ventral na linha média de aproximadamente um centímetro na região do pescoço. Em seguida, exponha o ponto de ramificação da LCA por dissecção contundente.
Lige as artérias carótida interna esquerda, carótida externa e occipital com suturas 6-0, deixando a artéria tireoidiana superior intocada. Feche a incisão com cola de tecido ou suturas. Transfira o rato para uma gaiola de recuperação pré-aquecida mantida a 37 graus Celsius.
Coloque o rato sobre uma toalha limpa por até uma hora para evitar hipotermia pós-cirúrgica. Insira uma agulha de calibre 21 na linha IV conectada através do ápice do coração no ventrículo esquerdo. Permitir a perfusão retrógrada por dois a três minutos usando solução salina normal à temperatura ambiente.
Mantenha uma taxa de fluxo constante aplicando pressão constante durante a injeção ou usando uma linha IV e mantendo o saco salino a uma altura de oito a nove pés. Remova a pele da região do pescoço com toda a gordura, músculos e tecidos conjuntivos para expor as artérias carótidas. Em seguida, remova os tecidos periadventícios ao redor das carótidas, deixando a carótida presa ao corpo.
Faça uma incisão abaixo do local da ligadura na ACV para permitir a perfusão. Perfundir a ACV através do ventrículo esquerdo por mais um minuto para remover quaisquer vestígios de sangue. Lave o exterior das artérias carótidas com solução salina normal para remover quaisquer vestígios de sangue.
Use uma seringa de insulina com uma agulha de calibre 29 para injetar 50 microlitros de tampão de digestão no lúmen da extremidade distal da artéria carótida esquerda. Use um microclipe para prender a extremidade proximal da artéria carótida cheia de tampão de digestão. Adicione 15 a 20 microlitros de tampão de digestão no lúmen e prenda a extremidade distal para evitar qualquer liberação de tampão de digestão.
Transfira as artérias carótidas do rato para placas de 35 milímetros contendo solução salina tamponada quente de 37 graus Celsius HEPES. E incube-os por 45 minutos a 37 graus Celsius com balanço intermitente. Remova a artéria carótida com os grampos do prato de 35 milímetros após a digestão enzimática luminal ser concluída.
Retire os grampos com cuidado, para que o tampão de digestão não vaze. Segure uma extremidade da artéria carótida em cima de um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Adicione 100 microlitros de tampão de digestão quente ao lúmen inserindo uma agulha de calibre 29 equipada com uma seringa de insulina.
Lave rapidamente o lúmen da artéria carótida no tubo de microcentrífuga e, em seguida, adicione 0,3 microlitros de FBS no tubo para interromper a reação. Coloque o tubo de microcentrífuga no gelo. Centrifugar as células a 500 G durante cinco minutos a quatro graus Celsius, utilizando uma centrífuga equipada com um rotor de ângulo fixo e eliminar o sobrenadante.
Ressuspenda as células em tampão de digestão, contendo reagente de dissociação celular, e incube-as por cinco minutos a 37 graus Celsius para separá-las em células únicas. Bloqueie a reação enzimática adicionando 0,15 mililitro de FBS ao tubo de 0,5 mililitro e repita a centrifugação. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 100 microlitros de solução gelada de 1% BSA em PBS em um tubo de microcentrífuga de 0,2 mililitros.
Para análise de célula única, ressuspeite o pellet com 100 microlitros de 1%BSA gelado em PBS em um tubo de 0,2 mililitros. Para análise de núcleo único, ressuscite a pastilha de célula em 100 microlitros de 0,04% BSA em PBS gelado e centrifugar a suspensão de célula única a 500G a quatro graus Celsius por cinco minutos. Decomponha a suspensão de célula única com tampão de lise gelado e incube por cinco minutos no gelo.
Misture o lisado com uma pipeta P20 e incube por mais 10 minutos. Depois, transfira o lisado em um tubo de 0,5 mililitro. Lave as células com 500 microlitros de tampão e misture-as com uma pipeta.
Em seguida, repita a centrifugação. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet de núcleos em 150 microlitros do tampão de núcleos diluídos. Conte as preparações de núcleos únicos usando um hemocitômetro.
Após o estudo de sequenciamento de núcleos únicos, núcleos únicos e de células únicas foram obtidos e visualizados por microscopia de campo brilhante e contraste de fase. A eficiência da preparação de núcleos únicos a partir da suspensão de célula única também foi demonstrada. Após o estudo de sequenciamento de RNA de célula única, vários parâmetros, como distribuição de genes por célula, identificador molecular único por célula, leituras mitocondriais por célula e dados de saturação de sequenciamento foram obtidos.
Para o estudo da sequência ATAC de célula única, observou-se a distribuição do tamanho da inserção, incluindo o padrão de bandas de nucleossomos. O escore normalizado de enriquecimento da SST também foi observado. Além disso, o fragmento percentual lê nos picos.
Fragmentos de região de pico, escore de enriquecimento da SST, razão de leituras nos locais genômicos da lista negra e razão de sinal de nucleossomo foram determinados. A digestão enzimática é um estresse para as células, portanto, é crucial manter as amostras no gelo e realizar o procedimento o mais rápido possível. Podemos usar este método para obter células endoteliais de camundongos.
Também podemos usar essa técnica para realizar estudos baseados em Omix em massa. Esta técnica abriu caminho para estudar o efeito do fluxo sanguíneo perturbado em células endoteliais in vivo de uma única maneira.
