في الأوعية الدموية ، يكون عدد الخلايا البطانية منخفضا جدا ، مما يجعل من الصعب دراستها. بروتوكولنا يلغي هذا القيد ، ويسمح لنا بدراسة المسارات الجزيئية والعلاجات الجديدة. يسمح لنا بروتوكولنا بالحصول على عينات مخصبة بطانية ، ودراسة كيفية تأثير التدفق المضطرب الحاد والمزمن على هذا النوع من الخلايا.
إن القدرة على دراسة الخلايا البطانية بمزيد من التفصيل تجعل من الممكن تحديد الجينات المستهدفة ، وبالتالي العلاجات المحتملة لتصلب الشرايين التي تستهدف الخلايا البطانية. عزل الشريان السباتي أمر صعب ، ويتطلب الصبر والخبرة. للبدء ، قم بإعداد الحيوان عن طريق حقن 0.05 ملليغرام لكل كيلوغرام من البوبرينورفين تحت الجلد.
تعقيم المنطقة المزيلة باستخدام محلول بيتادين والأيزوبروبانول ثلاث مرات. قم بعمل شق خط الوسط البطني يبلغ حوالي سنتيمتر واحد في منطقة الرقبة. ثم فضح نقطة فرع LCA عن طريق تشريح حاد.
قم بربط الشرايين السباتية الداخلية اليسرى والسباتية الخارجية والقذالي بخيوط 6-0 ، تاركا الشريان الدرقي العلوي دون مساس. أغلق الشق باستخدام غراء الأنسجة أو الغرز. انقل الماوس إلى قفص استرداد تم تسخينه مسبقا عند 37 درجة مئوية.
ضع الماوس على منشفة نظيفة لمدة تصل إلى ساعة واحدة لتجنب انخفاض حرارة الجسم بعد الجراحة. أدخل إبرة قياس 21 في الخط الوريدي المتصل عبر قمة القلب إلى البطين الأيسر. اسمح بالتروية الرجعية لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق باستخدام محلول ملحي عادي في درجة حرارة الغرفة.
حافظ على معدل تدفق ثابت من خلال تطبيق ضغط ثابت أثناء الحقن أو استخدام خط IV ، والحفاظ على الكيس الملحي على ارتفاع ثمانية إلى تسعة أقدام. إزالة الجلد من منطقة الرقبة مع جميع الدهون والعضلات والأنسجة الضامة لفضح الشرايين السباتية. ثم قم بإزالة الأنسجة المحيطة بالقناة حول السباتيدات تاركا السباتي متصلا بالجسم.
قم بعمل شق أسفل موقع الربط في LCA للسماح بالتروية. قم بدمج LCA من خلال البطين الأيسر لمدة دقيقة أخرى لإزالة أي آثار دموية. اغسل الجزء الخارجي من الشرايين السباتية بمحلول ملحي طبيعي لإزالة أي آثار للدم.
استخدم حقنة الأنسولين مع إبرة قياس 29 لحقن 50 ميكرولتر من مخزن الهضم العازل في تجويف الطرف البعيد من الشريان السباتي الأيسر. استخدم مشبكا صغيرا لتثبيت الطرف القريب من الشريان السباتي المليء بمخزن الهضم. أضف 15 إلى 20 ميكرولترا من المخزن المؤقت للهضم إلى التجويف ، وقم بقص الطرف البعيد لتجنب أي إطلاق للمخزن المؤقت للهضم.
انقل الشرايين السباتية من الفأر إلى أطباق 35 ملم تحتوي على محلول ملحي دافئ 37 درجة مئوية HEPES. واحتضنها لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع هزاز متقطع. قم بإزالة الشريان السباتي باستخدام المشابك من طبق 35 ملم بعد اكتمال الهضم الأنزيمي المضيء.
افصل المشابك بعناية ، بحيث لا يتسرب المخزن المؤقت للهضم. امسك أحد طرفي الشريان السباتي فوق أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 ملليلتر. أضف 100 ميكرولتر من مخزن الهضم الدافئ إلى التجويف عن طريق إدخال إبرة قياس 29 مجهزة بحقنة أنسولين.
اغسل تجويف الشريان السباتي بسرعة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق، ثم أضف 0.3 ميكرولتر من FBS إلى الأنبوب لوقف التفاعل. ضع أنبوب الطرد المركزي الصغير على الجليد. قم بطرد الخلايا مركزيا عند 500 G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ، باستخدام جهاز طرد مركزي مجهز بدوار ثابت الزاوية وتخلص من السوبرنات.
أعد تعليق الخلايا في مخزن الهضم العازل ، الذي يحتوي على كاشف تفكك الخلايا ، واحتضنها لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية لفصلها إلى خلايا مفردة. منع التفاعل الإنزيمي عن طريق إضافة 0.15 ملليلتر من FBS إلى أنبوب 0.5 ملليلتر، وتكرار الطرد المركزي. تخلص من السوبرناتانت ، وأعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من محلول 1٪ BSA البارد في PBS في أنبوب طرد مركزي صغير 0.2 ملليلتر.
لتحليل خلية واحدة ، أعد تعليق الكريات مع 100 ميكرولتر من الثلج البارد 1٪ BSA في PBS في أنبوب 0.2 ملليلتر. لتحليل النواة المفردة ، أعد تعليق حبيبة الخلية في 100 ميكرولتر من 0.04٪ BSA في PBS البارد الجليدي ، وقم بالطرد المركزي لتعليق الخلية الواحدة عند 500G عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تحلل تعليق الخلية الواحدة باستخدام مخزن مؤقت للتحلل البارد المثلج ، واحتضنه لمدة خمس دقائق على الجليد.
امزج الليزات مع ماصة P20 ، واحتضنها لمدة 10 دقائق أخرى. بعد ذلك ، انقل الليزات في أنبوب 0.5 ملليلتر. اغسل الخلايا ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت ، واخلطها باستخدام ماصة.
ثم كرر الطرد المركزي. تخلص من السوبرناتانت ، وأعد تعليق حبيبات النوى في 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنوى المخففة. عد مستحضرات النوى المفردة باستخدام مقياس الدم.
بعد دراسة تسلسل النوى المفردة ، تم الحصول على خلية واحدة ونوى واحدة وتصورها بواسطة مجهر المجال الساطع وتباين الطور. كما تم إثبات كفاءة إعداد النوى المفردة من تعليق الخلية الواحدة. بعد دراسة تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ، تم الحصول على معلمات مختلفة مثل توزيع الجينات لكل خلية ، والمعرف الجزيئي الفريد لكل خلية ، وقراءات الميتوكوندريا لكل خلية ، وبيانات تشبع التسلسل.
بالنسبة لدراسة تسلسل ATAC أحادية الخلية ، لوحظ توزيع حجم الإدراج ، بما في ذلك نمط النطاقات النيوكليوسومية. كما لوحظت درجة التخصيب TSS العادية. بالإضافة إلى ذلك ، يقرأ الجزء المئوي في القمم.
تم تحديد شظايا منطقة الذروة ، ودرجة إثراء TSS ، ونسبة القراءات في مواقع الجينوم في القائمة السوداء ، ونسبة إشارة النيوكليوسومات. الهضم الأنزيمي هو إجهاد للخلايا ، لذلك من الأهمية بمكان الحفاظ على العينات على الجليد ، وتنفيذ الإجراء في أسرع وقت ممكن. يمكننا استخدام هذه الطريقة للحصول على الخلايا البطانية ولوحتها من الفئران.
يمكننا أيضا استخدام هذه التقنية لإجراء دراسات قائمة على Omix بالجملة. مهدت هذه التقنية الطريق لدراسة تأثير تدفق الدم المضطرب على الخلايا البطانية في الجسم الحي بطريقة خلية واحدة.
