このビデオ Hi.In、灌流マウス心臓の過分極MR研究を実行する方法を学びます。ラボのMD / PhDの学生であるDavid Shaulが、さまざまなテクニックと手順をガイドします。今日、私たちは、31P NMR分光法と組み合わせて、過分極炭素13ピルビン酸代謝を研究するためのプロトコルを学びます。
ピルビン酸代謝は、好気性代謝と嫌気性代謝の交差点に立っています。そしてそのように、それは心臓の様々な状態を研究するために非常に価値があります。それでは、始めましょう。
マウスの心臓を単離し、10ミリメートルNMRチューブ内でクレブスヘンスライトバッファーで灌流します。次に、心臓をNMR分光計に挿入します。そこでは、アデノシン三リン酸、ホスホクレアチン、無機リン酸の共鳴を観察することにより、心臓のエネルギーとpHを観察するために31Pスペクトルが記録されています。
一方、最初の位置で炭素13で標識されたピルビン酸サンプルは過分極しています。そして、溶解が起こった後、それは心臓に注入され、乳酸、無機物、ピルビン酸の組織化された活動をリアルタイムで測定できるようにします。実験の前日に、400ミリリットルの修飾クレブス - ヘンゼライト緩衝液を調製する。
最初のステップとして、これらの成分を二重蒸留水で解決します。次に、この溶液をこの酸素混合物で20分間泡立ててから、塩化カルシウムを加えます。pHを7.4に調整します。
実験当日、グルコースとインスリンを加えます。ウォーターバスを摂氏40度に設定します。200ミリリットルのKHバッファーを入れたミディアムボトルをバスに挿入します。
蠕動ポンプを使用してKHバッファーをリサイクルします。それに接続し、1つの流入ラインと2つの流出ラインを接続します。流入ラインと流出ラインを加熱されたKHバッファーに挿入します。
95%O2と5%CO2の酸素ミキサーを使用してください。次に、加熱されたKHバッファーに酸素ラインを挿入します。蠕動ポンプの電源を入れ、毎分7.5ミリリットルの一定の流量に調整します。
心臓を導入する前にシステムを調整したい。そのため、流入ラインと流出ラインを10ミリNMR管に挿入し、NMR対応の光温度プローブを挿入します。NMRチューブをマグネットボアに挿入します。
加熱タンクを摂氏42度に調整し、NMR加熱を使用して磁石内の温度を摂氏37度に調整します。なお、NMRの温度は、NMR対応の温度コアを用いて、磁石内部のKHバッファーで実際に監視されます。これで、31P分光法を使用して、バッファー内の無機リン酸塩のシグナルを観察できます。
これは外科手術に必要な機器です。100ミリリットルのKHバッファーを氷に入れ、同じ酸素混合物で泡立てます。ボックスチャンバー内のマウスを、誘導用の室内空気と混合した3.3%イソフルランで、毎分340ミリリットルの流量で麻酔します。
マウスを鼻麻酔に移します。同じ流速で2.9%イソフルランに還元する。足をつまんで、負のペダル痛反射を確認し、マウスが完全に麻酔されていることを確認します。
マウスに300単位のヘパリンナトリウムを腹腔内に注射する。剣状突起の2センチ下で皮膚を切ります。腹壁を切って腹腔を露出させます。
剣状突起と胸部皮膚の間にシザークランプを配置し、それを使用して胸壁を引っ込め、横隔膜を露出させます。横隔膜の右葉に穴を開けてから、横隔膜の残りの部分を切り取ります。心臓や血管などのより深い臓器との接触を避けながら、胸壁の正中線を横切って切断します。
心臓の左心室に200単位のヘパリンナトリウムを注射します。心停止を達成するために0.1ミリリットルの0.5モルのKCLを心臓に注射する。胸腺組織を前方に引っ込め、その根元から切り取って、その下の大動脈を露出させます。
大動脈への損傷を避けながら、できるだけ多くの胸腺組織を取り除くようにしてください。静脈内カテーテルが自由に通過できるように、残りの胸郭組織を取り除きます。湾曲した鉗子を大動脈の下に置き、それを使用して大動脈の周りに絹縫合結び目を配置します。
湾曲した鉗子を大動脈根に置き、心臓を下方に引っ込めて大動脈を露出させて伸ばします。3ミリリットルの氷冷KHバッファーを左心室に注入して、大動脈から血栓を取り除き、心臓の生存率を維持します。心臓の表面にも数滴を置きます。
静脈内カテーテル針を使用して、後壁を損傷することなく大動脈の動脈壁を穿刺します。次に、針でカテーテルを約3ミリメートル挿入します。その後、針を外し、同時にカテーテルチューブをさらに5ミリメートル挿入しますが、左心室には入らないようにします。
シアノアクリレート接着剤を大動脈の穿刺領域に配置し、縫合糸を締め付けながらカテーテルチューブが大動脈から滑り落ちるのを防ぐ。大動脈とカニューレチューブの間に結び目をそっと二重にします。さらに5ミリリットルのKHバッファーを左心室に注入し、カニューレ挿入チューブを通って流れることを確認します。
これは、カニューレ挿入が成功したことを示します。大動脈根から湾曲した鉗子を取り外します。カニューレ挿入剤や心臓組織との接触を避けながら、心臓を周囲の内臓から切り離します。
すぐにカニューレを流れる氷冷KHバッファーシリンジに接続します。心臓への気泡の導入を避けることが重要です。非心臓組織を取り除きます。
この段階で、心臓の再開鼓動を観察する必要があります。残りのシルク縫合糸の端を切ります。NMR室で、カニューレをシリンジから外し、灌流系の37度KHバッファーに接続します。
次に、心臓を10ミリNMRチューブに挿入します。心臓をプローブの中央に配置し、心臓を入れたNMRチューブをNMR分光計のボアに挿入します。10〜20ヘルツの線幅が達成されるまで、1Hチャネルの水信号を使用してシムを実行します。
次に、定常状態で50度のフリップ角度と1.1秒のTRを使用して、心臓の31Pスペクトルを取得します。これらの条件は、PCrおよび無機リン酸のシグナルよりもATPのシグナルに有利である。ATPおよびPCrのシグナルを観察することは、組織がNMR分光計内で生存可能であることを意味する。
専用の処理プログラムを使用してスペクトルを解析します。7ヘルツの指数関数的アップライゼーションを実行します。ベースライン補正を使用してから、クレアチンホスホシグナルをマイナス2.5ppmに割り当てます。
無機リン酸、ホスホクレアチン、およびATPのシグナルを観察します。ピルビン酸のサンプル、つまり最初の位置を炭素13で標識したサンプルを80分間分極します。80分の分極後、サンプルは溶液の準備ができています。
これが溶解が起こる方法です。連続灌流アプローチを使用して溶解内容物を心臓に注入します。このアプローチは、組織の灌流および酸素化レベルを中断することなくピルビン酸を送達するように設計されました。
過分極ピルビン酸を含む溶液培地を円錐管に注入し、次にバイパスに手動で注入し、次にバイパスを介して灌流を指示し、バイパス内容物が心臓を連続的に流れ、最終的に洗い流されます。毎分7.5ミリリットルの灌流速度と22ミリリットルのバイパス容量を使用します。そのため、過分極した媒体が心臓を約3分間流れていること。
この時間ウィンドウでは、炭素13分光法を使用して、ピルビン酸、乳酸、および重炭酸塩のシグナルを測定します。乳酸励起と重炭酸塩励起を6秒間隔で交互に行う励起スキームを使用します。飽和選択励起を用いて炭素13シグナルを取得しました。
このアプローチでは、基質ピルビン酸は最小限に興奮し、代謝産物である乳酸塩および重炭酸塩は完全に励起される。炭素13ピルビン酸代謝を約3分間観察して記録します。代謝調査は、ピルビン酸シグナルが減衰した後に終了します。
この図は、KHバッファーを灌流したマウス心臓から記録された31Pスペクトルを示しています。心臓から取得したスペクトルは、アルファ、ベータ、ガンマATP、PCr、およびPiのシグナルを示し、Pi信号は2つの主要な成分で構成され、より高いフィールドに現れる左側の成分は、主にpH7.4のKHバッファーに起因するPi信号を表しています。右側の境界と均質でない成分は、より低いフィールドにあり、より酸性の環境にあるPi信号を示しています。
この成分は心臓組織から生じます。次に、Pi信号全体からバッファPi信号を差し引くことにより、組織のPi信号を得た。その後、ppmスケールからpHスケールに変換されました。
pHは、加重平均、加重中央値、グローバル最大値、および歪度を計算することにより、組織Pi信号のマルチパラメトリック分析を使用して調査されます。この図は、灌流マウス心臓への過分極炭素13ピルビン酸注入中に、過分極生成物選択的飽和励起アプローチを使用して得られた典型的な炭素13NMRスペクトルを示しています。乳酸ピルビン酸と重炭酸塩のシグナルに注目してください。
ピルビン酸信号は、表示目的でここで切り捨てられます。基質および代謝物のシグナル強度の変化は、T1緩和、励起頻度、および流動特性によるものである。次に、これらの信号の積分強度をプロットします。
さらに、32秒の実効減衰時定数を使用して、T1崩壊と4D周波数励起の影響について収集されたピルビン酸積分強度を黒丸でプロットしました。この補正により、基板に対して期待される流動ダイナミクスが得られることがわかりました。ウォッシュイン、プラトー、ウォッシュアウト。
この補正された信号の時間経過を使用して、さらなる分析のために、NMRチューブ内のピルビン酸濃度が一定で最大である水色で強調表示されている時間ウィンドウを選択しました。LDHとPDHの割合は、選択した各時間ポイントについて計算され、平均化されました。この注射の主な値は、ナノモル/秒の単位で提供されます。
要約すると、灌流マウス心臓において過分極ピルビン酸代謝研究を行うための実験系を示した。この情報がお役に立てば幸いです。
