この方法は、腎臓へのマイクロRNAの治療における重要な質問に答えるのに役立ちますが、これは依然として課題です。この技術の主な利点は、インターフェロン反応や遺伝的不安定性を引き起こすことなく、腎臓へのマイクロRNA模倣物の治療を可能にすることです。10マイクロリットルのPEI-NPを1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブ内の90マイクロリットルの5%グルコース溶液に溶解することから始めます。
次に、チューブを静かに渦巻き、回転させます。100マイクロモルのヌクレアーゼフリー水に溶解した50マイクロリットルの人工合成miRNAと50マイクロモルの10%グルコース溶液を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブで混合します。チューブを静かに渦巻き、回転させます。
このプロセスにより、5%グルコース溶液に溶解したmiRNAが得られます。次に、100マイクロリットルのPEI-NPを5%グルコース溶液に混合し、100マイクロリットルのmiRNA模倣物を5%グルコース溶液に混合します。チューブを静かに渦巻き、回転させます。
混合物を室温で15分間インキュベートして、PEI-NPsmiRNA模倣物の安定な複合体を調製する。2マイクロリットルのPEI-NPを1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブ内の98マイクロリットルの10%グルコース溶液に溶解します。チューブを静かに渦巻き、回転させます。
次に、100マイクロリットルのCy3標識miRNA模倣物を10%グルコース溶液中の100マイクロリットルのPEI-NPに加え、チューブを穏やかにボルテックスします。混合物を室温で15分間インキュベートして、PEI-NPs-Cy3標識-miRNA模倣体の安定な複合体を調製します。UUOマウスの頭を麻酔なしで50ミリリットルの遠沈管に入れ、次にキャップの準備された穴に尾を通します。
1ミリリットルの注射器に、200マイクロリットルのPEI-NPs-Cy3標識miRNA模倣複合体を含む30ゲージの針を充填し、マウスの尾静脈を介して複合体を注入します。次に、外科用ハサミと鉗子で皮膚、筋肉、肋骨を切開し、心臓を露出させます。右心房を切開した後、腎臓の色が淡黄色に変わるまで左心室にPBSを注入します。
これは、マウスの体全体がPBSで灌流されていることを示しています。腎臓を集めた後、腎カプセルを取り外し、PBSで2回洗浄します。腎臓組織サンプルをOCTコンパウンドに埋め込み、液体窒素で凍結します。
クライオスタットを使用して切片を準備し、シランコーティングされたスライドガラスに切片を取り付けます。それらを4%パラホルムアルデヒドで固定し、スライドをPBSで2回静かに洗浄します。最後に、100倍および400倍の倍率の蛍光顕微鏡と適切なイメージングソフトウェアによって蛍光染色を視覚化します。
代表的な画像は、PEI-NPs-miRNA模倣複合体の構造を示す。腎線維症におけるPEI-NPを用いたmiRNA-146a-5p-模倣体の送達および効果をこれらの画像に示している。蛍光顕微鏡分析は、PEI-NPの尾静脈注射がmiRNA模倣体を尿細管間質腔に送達できることを示しました。
UUOによって作製された腎線維症マウスでは、これには腎臓および糸球体に規則的な形態を持たない腎尿細管細胞が含まれていた。qRT-PCR分析は、PEI-NPs-miRNA-146a-5p-模倣物の注射が腎臓におけるmiRNA-146a-5pの有意な過剰発現を誘導することを示した。シリウス赤色染色による組織学的分析をここに示す。
蛍光顕微鏡分析により、PEI-NPの尾静脈注射は、in vivoで糖尿病腎臓モデルマウスの腎臓の糸球体および尿細管間質腔にmiRNA模倣体を送達できることを示しました。さらに、qRT-PCR分析は、PEI-NPs-miRNA-181b-5p-模倣物の注射が腎臓におけるmiRNA-181b-5pの有意な過剰発現を誘導することを示した。周期的酸-シッフ染色による組織学的分析は、10〜20週齢の週1回、PEI-NPs-miRNA-181b-5p-模倣物の注射がマウスの糖尿病性腎疾患の進行を抑制することを示した。
虚血再灌流傷害により作製した急性腎障害モデルマウスにおけるPEI-NPs-miRNA-5100-模倣体の送達および効果をここに示す。PEI-NPs-miRNA-5100-模倣体の注射後のmiRNA-5100の過剰発現効果を評価するための蛍光顕微鏡分析qRT-PCR分析のデータと、ヘマトキシリン-エオジン染色された腎臓の組織学的分析がこれらの画像に描かれています。虚血再灌流障害(IRI)の2日前に尾静脈を介して注射されたPEI-NPは、IRIによって誘発される急性腎障害の進行を防ぎます。
この技術を実行するときは、できるだけ多くの腎臓組織を含む5マイクロメートルの厚さの切片を準備してください。厚さ7マイクロメートルの切片も用意できます。
