我々のオルガノイドモデルは、新生児腺の成熟、加齢に伴う機能低下、腺における腫瘍増殖など、恒常性および下垂体リモデリング条件における下垂体幹細胞生物学を探索するのに非常に貴重である。今日まで、私たちの下垂体オルガノイド技術は、初代マウス下垂体幹細胞を確実かつ堅牢に増殖および増殖させるための唯一の利用可能なツールです。手順を実証するのは、私の研究グループの博士課程の学生であるEmma LaporteとCharlotte Nysです。
まず、マウスの頭を脱イオン水で洗って血液を取り除きます。70%エタノールを頭部にスプレーして、無菌環境を生成する。その後、滅菌手術器具を用いて耳の間の皮膚を除去する。
頭蓋を開くには、滅菌ハサミでノーズブリッジを壊します。さらに、鼻橋から両側の耳に向かって頭蓋を開きます。下垂体に触れることなく滅菌ピンセットで頭蓋と脳を取り除きます。
ダイヤフラムセラを鈍いピンセットで取り外します。次いで、実体顕微鏡下で、前葉を後葉および中間葉から分離する。鈍いピンセットで前葉を慎重に分離し、3ミリリットルの培地Aを含む10ミリリットルの三角フラスコに集めます。
摂氏37度で15分間インキュベートする。2ミリリットルの予め加温したDNAse溶液を加え、三角フラスコを10回旋回させる。下垂体を底に沈め、上清を取り除きます。
予め加温したトリプシン阻害剤溶液2ミリリットルを加え、摂氏37度で10分間インキュベートする。下垂体が底に沈んだら上澄み液を取り除きます。予め加温した培地Bを2ミリリットル加え、5分間インキュベートする。
これに2ミリリットルの予め加温した培地Cを加え、15分間インキュベートする。下垂体を底に沈め、上清を取り除きます。その後、予め加温した培地C.2ミリリットルの予め加温した培地C.Aspirateを加え、無菌の火炎研磨パスツールピペットで下垂体を複数回排出し、断片が見えなくなるまで3回すすいでください。
懸濁液を、4.5ミリリットルの予め加温されたDNAse溶液を含む15ミリリットルのチューブに移す。フラスコを2ミリリットルの予め加温した培地Cで3回すすぎ、懸濁液をチューブに移す。回収した細胞懸濁液を混合し、40ミクロンのセルストレーナーを通して30ミリリットルのチューブに濾過する。
チューブとセルストレーナーを2ミリリットルの培地Cで3回すすぎ、懸濁液をチューブに移します。ガラスパスツールピペットに2ミリリットルのBSAを入れます。ピペットの先端をチューブの底に置き、静かにピペットを出して、目に見える密度層を形成します。
Gの190倍で4°Cで10分間遠心分離する。上清を除去し、細胞ペレットを1ミリリットルの氷冷高度DMEM/F-12に再懸濁する。次に、セルカウンターで細胞を定量する。
細胞懸濁液を摂氏4度で10分間、190倍Gで遠心分離し、上清を除去した。細胞ペレットを高度なDMEM/F-12に再懸濁して、1ミリリットルあたり10〜6番目の細胞の1.1倍の細胞密度に達する。ECMを所望の体積の細胞懸濁液に30:70の比率で加え、よく混合する。
この混合物の30マイクロリットル滴を、予め加温した48ウェルプレートの各ウェルに堆積させる。プレートを裏返し、ECMを摂氏37度で20分間固化させます。インキュベーション後、10マイクロモルのROCK阻害剤を添加した250マイクロリットルの予め加温した下垂体オルガノイド培地を慎重に加える。
2~3日ごとに、オルガノイドが完全に増殖するまでROCK阻害剤を含まない培地を10~14日間交換する。オルガノイドを通過させるには、まず培地を穏やかに吸引し、400マイクロリットルの氷冷高度DMEM/F-12を加えてECMを崩壊させる。次いで、オルガノイドを微量遠心管に集める。
400マイクロリットルの氷冷高度DMEM/F-12で井戸を洗ってください。チューブを200倍Gで4°Cで5分間遠心分離します。上清を除去し、予め加温したTrypLE Express酵素400マイクロリットルを加える。
チューブを数回反転させて混合し、摂氏37度で5分間インキュベートする。400マイクロリットルの氷冷高度DMEM/F-12を加える。Gで200回で4°Cで5分間遠心分離し、上清を除去した。
ペレットを100マイクロリットルの氷冷高度DMEM/F-12で再懸濁する。P-200先端を狭くし、その先端を使用して、オルガノイド断片が得られるまで激しくピペッティングすることにより、オルガノイドを解離させる。800マイクロリットルの高度なDMEM/F-12を追加します。
4°Cで10分間Gを190回で遠心分離し、上清を除去した。オルガノイドを通過させるには、ペレットを適切な量の高度なDMEM/F-12で再懸濁し、ECMを30:70の比率で加える。よく混ぜる。
テキスト原稿に記載されているようにオルガノイドを種まきし、培養し続ける。前葉から解離した単一細胞をECMに播種し、下垂体オルガノイド培地中で増殖させた。播種後14日後、オルガノイドは完全に発達し、最大500マイクロメートルの直径に達した。
この段階で、オルガノイドは、内腔を囲む上皮層を有する嚢胞性形態を示した。成長後に緻密な構造が現れる井戸を使用することは推奨されません。継代のために、オルガノイド断片を播種に使用した。
継代後7日目に、嚢胞構造で良好なオルガノイド再増殖が観察された。高密度オルガノイドは、好ましくないオルガノイドが培養物を引き継ぐ可能性があるため、廃棄する必要があります。上皮マーカーE-カドヘリンおよびサイトケラチン8および18についての免疫蛍光染色分析は、オルガノイドの上皮特性を確認した。
下垂体幹細胞マーカーSox2およびTrop2の発現はステム性を示し、下垂体特異的マーカーLHX3はオルガノイドの下垂体表現型を示した。マーカーKi67の発現は、オルガノイド構成細胞が増殖状態にあることを示した。RTQ PCR解析では、複数回継代後においてもオルガノイドにおいて前葉よりもステムネスマーカーの発現が高いことが示され、幹細胞の濃縮性を検証した。
最初の播種時にECMドーム内に適切な数の単一細胞をプレートすることが重要であり、オルガノイドを継代するときは、単一細胞ではなく断片を再播種することを忘れてはならない。
