このプロトコルは、マウスモデルにおける様々な文脈における脳の調節における脈絡叢および末梢免疫細胞の役割に関する疑問に対処するのに有用であり得る。このプロトコルは、マウスの脈絡膜叢におけるユニークな免疫細胞集団の詳細な定量的および定性的な分析を可能にする。脈絡叢の解剖は、その小さなサイズと透明な色のために、最初は難しいことがあります。
最初に灌流されていない動物で練習することをお勧めします。まず、C57ブラック6匹のマウス背側から解剖した脳をペトリ皿に上向きに置き、皿を両眼ループの目的の下に置きます。鉗子を使用して脳を所定の位置に保ちながら、別の一対の鉗子の両端を半球間の正中線を通して挿入します。
鉗子を使用して、脳梁と海馬のある皮質を中隔から引き離し、側脳室と第3心室の一部を露出させます。側脈絡叢を、側心室を裏打ちし、両端でフレアリングする長いベールとして識別する。次に、薄い鉗子の両端を用いて、側方脈絡叢を採取する。
海馬の後襞に隠れている三角形の後部を集めるように注意してください。次に、対側半球の脳梁と海馬のある皮質を中隔から引き離し、第3心室全体と反対側の外側心室を露出させます。微細な鉗子を用いて、粒状の表面アスペクトを有する短い構造として同定された第3の脈絡叢を収集する。
次に、他の側索叢を集める。次に、鉗子の両端を小脳と中脳の間に挿入し、小脳をポンと髄質から切り離して第4心室を露出させます。次に、第4の脈絡叢を、小脳と髄質の間の側方右端から左端に第4心室を並ぶ顆粒状表面側面を有する長い球状構造として同定する。
微細な鉗子を用いて、第4の脈絡叢を採取する。採取した全ての脈絡叢をコラゲナーゼIVと共にインキュベートした後、約10回程度ピペットを上下に穏やかにピペットし、解離を確定させた。次いで、チューブをMACS緩衝液で1.5ミリリットルに充填し、コラゲナーゼIV活性を停止させた。
次に、細胞を遠心分離し、上清を捨ててから、細胞を1.5ミリリットルのMACS緩衝液で洗浄する。適切な補償ビーズおよび抗体溶液を加えた後、サンプルを氷上で30〜45分間インキュベートし、光曝露から保護する。次に、チューブに1.5ミリリットルのMACSバッファーを充填し、細胞と補償ビーズを遠心分離します。
細胞および補償ビーズを500マイクロリットルのMACS緩衝液に再懸濁した後、70ミクロンのストレーナーを通して細胞を濾過する。フローサイトメーターとソフトウェアの電源を入れた後、サイズに基づいて前方散乱領域と側方散乱領域とゲートセルを選択します。次に、前方散乱面積対前方散乱高さを持つ単一セルのドーターゲートを作成します。
次に、DAPI陽性細胞を除外するために、DAPI対前方散乱領域を有する生細胞用のドーターゲートを作成する。次に、CD45対前方散乱領域を有するCD45陽性免疫細胞のための娘ゲートを作成する。次に、CD45陽性細胞からドーターゲートを作成し、F480対CD11bを選択して、CD11b陽性F480陽性およびCD11b陽性F480陰性集団を同定する。
次に、CD11b陽性F480陽性細胞のドーターゲートを作成し、CX3CR1対IA-IEを選択して、CX3CR1陽性IA-IE陽性境界関連マクロファージおよびCX3CR1陽性IA-IE陰性マクロファージの両方を同定した。次に、CD11b陽性F480陽性CX3CR1陽性IA-IE陰性マクロファージのドーターゲートを作成し、F480対CD11bを選択して、CD11b陽性F480中間CX3CR1陽性IA-IE陰性コルマーエピプレクサスマクロファージおよびCD11b陽性F480高CX3CR1陽性IA-IE陰性境界関連マクロファージの両方を同定する。次いでCD11b陽性F480陰性集団から、Ly6C対IA−IEのゲートを得た。
主に単球または好中球に対応するIA−IE陽性Ly6C陰性集団およびIA−IE陰性Ly6C陽性細胞の両方を選択する。最後に、CD11b陽性F480陰性IA-IE陽性Ly6C陰性集団のドーターゲートを作成し、CD11b対CX3CR1を選択します。次に、CD11b高CX3CR1低およびCD11b陽性CX3CR1陰性集団の両方を同定する。
T細胞ゲーティングの場合、前述のようにDAPI陽性細胞を除外した後、CD45対FSC-Aを有するCD45陽性免疫細胞のドーターゲートを作成し、次いでCD45陽性細胞からドーターゲートを作成し、TCRベータ対CD11bを選択する。最後に、TCRベータ陽性CD11b陰性集団のドーターゲートを作成し、CD4対CD8aを選択する。
CD8陰性およびCD4陽性T細胞ならびにCD8陽性CD4陰性T細胞の両方を同定する。ここで実証されたフローサイトメトリー分析は、骨髄系およびT細胞の主要なサブセットと、マウス1匹あたりのそれらの相対的な総数を再現性の高い方法で明らかにすることに成功しました。骨髄系細胞のフローサイトメトリー分析は、脈絡叢がCD11b陽性CX3CR1陽性F480高境界関連マクロファージによって移入され、脈絡叢におけるCD45陽性免疫細胞の80%を表すことを示す。
コルマーエピプレクサスマクロファージのCD11b高F480中間体CX3CR1陽性IA−IE陰性集団も同定された。CD11b陽性F480陰性免疫細胞のうち、Ly6C陰性IA−IE陽性細胞の2つの異なる集団が特徴付けられ、樹状細胞に対応する可能性が高い。T細胞の分析およびゲーティング戦略は、CD45陽性CD11b陰性TCRベータ陽性細胞の少数集団の存在を強調した。
このうち、マウス1匹あたり約30~50個のCD8陰性CD4陽性およびCD8陽性CD4陰性T細胞が生理的条件下で脈絡叢に移入した。血液汚染は脈絡叢の免疫組成をぼやけさせる可能性があるため、灌流の質を制御することが重要です。この方法に続いて、バルクまたは単一細胞RNAシーケンシングなどのさらなる分析のために、選択された細胞集団をソートすることができる。
