ゼブラフィッシュは魅力的なモデルですが、科学者たちは生物が水媒介性投薬でどれだけ取り込んでいるのか分かりません。暴露後の組織を消化し、ICPMSを介して金属を定量化する技術を開発しました。この技術により、ICPMSを用いて線量反応を正確に定量化し、検証することができます。
この方法は多くの可能性を秘めています。薬理学的または環境的金属曝露は、細胞レベルから動物モデルの器官系全体まで適用することができる。約0.25ミリリットルの高純度硝酸を15ミリリットルのポリプロピレン遠沈管に加え、最大10匹の幼虫を飼育する。
サンプルを事前に消化するために1時間超音波処理します。超音波処理のために、すべての組織が目に見えて酸化され、均一で透明な黄色の溶液を生成するまで、酸安全なマイクロ波消化器で5分間隔で組織消化の短いサイクルを実行します。チューブの完全性を注意深く監視して破裂を防ぎ、サイクル間の遠心分離機で短いスピンを行います。
組織が目に見えて酸化されたら、ヒュームフード内のサンプルを6.75ミリリットルの高純度水と渦を使用して3.5%硝酸に希釈し、完全に混合します。次に、マトリックスマッチングされた7点検量線を実施して、潜在的な等圧干渉を考慮します。水性認定元素規格のストック濃度を使用して、0.1ミリリットルのアリコートを取り、ピペットによって新しい15ミリリットルの遠沈管に入れた。
3.5%硝酸で希釈して最終容量10ミリリットルにし、10 ppmの標準溶液を生成します。10 ppm の在庫を使用して、3.5% 硝酸で 0.1、1.0、および 5.0 ppm の標準溶液を連続希釈します。0.1 ストックを使用して、3.5% 硝酸で 0.001、0.005、および 0.01 ppm の標準溶液を連続希釈します。
次に、サンプル分析用のICPMS機器を準備する前に、アルゴンガスバルブが開いており、すべてのチューブがしっかりと接続され、清潔で、5%硝酸がサンプル分析間のチューブとガラス製品をすすぐために開いていることを確認してください。トーチとコーンの状態を確認し、トーチボックスがしっかりとラッチされていることを確認します。そしてスプレー室排水管はペリポンプに正しく接続されている。
ソフトウェアを開き、真空測定値を確認し、すべてのターボポンプが100%で動作していることを確認します プラズマ制御システムのステータスウィンドウでSTARTをクリックして、開始シーケンスを開始します。プラズマポンプとプラズマチラーの電源を入れ、ネブライザーをとまり、プラズマを点灯させます。ステータスウィンドウに起動シーケンスが完了したことが示されたら、プラズマが点灯して安定するのを待ちます。
この時点で、システム状態ウィンドウの緑色の点が、すべての電源機構がオンになっていることを示します。メニューバーで、ドロップダウンメニューのコントロール、オートサンプラーをクリックします。5%硝酸を含むチューブのオートサンプラーラック位置を入力し、酸が血漿に入るのを許します。
メニューバーで、ドロップダウンメニューの[スキャン]、[マグネット]をクリックします。「マグネットスキャン」ウィンドウで、「マーカーの質量位置」に「115」と入力し、「Enter」をクリックします。装置がウォームアップしている間、磁石が質量範囲を横切って30分間スキャンするのを許します。
30 分後、オートサンプラー コントロールを使用して、10 億分の 1 の多要素チューニング ソリューションの位置に移動します。チューニングソリューションを吸引し、楽器をチューニングして信号の読み取りを最適化します。X、Y、Z 座標のトーチ位置を調整して、トーチがプラズマ制御ウィンドウのコーンとネブライザーの流量の中心に揃うようにします。
「イオン光学チューニング」ウィンドウで、ソース、検出器、および分析装置に必要な調整を行います。信号の読み取り値が最適化されたら、[マグネットスキャン]ウィンドウで[停止]をクリックし、[マグネットのキャリブレーション]をクリックして、ポップアップウィンドウで[低解像度]を選択します。[OK]をクリックし、質量校正SMCファイルを開いて磁石を校正します。
[保存]、[使用]をクリックして、現在のマグネット キャリブレーションを解析に適用します。広範囲の濃度で未知のサンプルを測定する場合は、検出器の校正を実行して、低濃度のイオンパルスカウント信号と高濃度で生成される減衰イオン信号を比較します。サンプル分析を開始するには、[データ集録]をクリックし、ドロップダウンメニューの[メソッド設定]をクリックします。
製造元から提供された既存の方法を使用するか、目的の要素に基づいて方法を作成します。必要に応じて、解析モード、滞留時間、スイッチ遅延、スイープとサイクル数、分解能、検出モード、パークマスを調整して、ディフレクターを設定します。「保存」をクリックして、メソッド設定を記録します。
各金属およびアイソタイプのパラメータを最適化します。メニューバーで、[データ集録]をクリックします。ドロップダウンメニューの[バッチ実行]をクリックします。
または、メニューバーの下にあるBATCHアイコンをクリックするか、スプレッドシートからバッチパラメータをートするか、[バッチ実行]ウィンドウでシーケンスを作成します。サンプルタイプ、オートサンプラーラック位置、搬送時間、洗浄時間、反復、サンプルID、およびメソッドファイルを入力します。検量線用の標準解のバッチ実行を手配し、続いて品質管理標準、次に未知のサンプルを配置します。
5~10サンプルごとに0.5 ppmの品質管理基準を含めることで、機器のドリフトとサンプルの再現性を監視します。組織取り込み研究は、シスプラチンおよび新規ルテニウムベースの抗癌化合物PMC79の水媒介性曝露を用いて実施された。致死性および孵化遅延を、シスプラチンの公称濃度について評価した。
シスプラチン1リットルあたり0、3.75、7.5 15、30および60ミリグラム。生物組織における白金蓄積はICPMS分析によって決定され、生物組織は生物当たり0.05、8.7、23.5、59.9、193.2、および461.9ナノグラムのそれぞれの用量を含んでいた。孵化の遅延は、全てのシスプラチン濃度で観察された。
脱絨毛後、絨毛膜を回収し、白金について別々に分析した。脱絨毛試験に使用された非致死量のシスプラチンは、シスプラチンの総送達用量の93〜96%が絨毛膜に蓄積し、残りの用量が幼虫組織内に蓄積したと判断した。ゼブラフィッシュ幼虫をPMC79の1リットル当たり0、3.1、6.2、9.2、および12.4ミリグラムに曝露した。
これらの濃度は、ルテニウム1リットル当たり0、0.17、0.44、0.66、および0.76ミリグラムを含むと分析的に決定された。このシスプラチンとは異なり、PMC79ばく露幼虫では孵化の遅延は認められなかった。絨毛膜は幼虫の収集前に自然に分解されるため、ルテニウム分析には含まれなかった。
各濃度で分析された幼虫組織内の巨大な金属は、幼虫あたり0.19、0.41、および0.68ナノグラムのルテニウムであった。曝露プロトコルに添加された試薬のいずれかが、等圧干渉の可能性を与える。可能であれば、トリカインと比較して急速冷却などの代替案を検討してください。
この方法は、毒性、有効性、実験のための金属用量定量を、より高い脊椎動物間で比較することを可能にする。特に、閾値線量が患者に与えられた桁違いの線量内であることに興奮しました。
