Nous présentons des masses fondamentales, mais très demandées pour l’élevage de masse, des observations et des études moléculaires utilisant des masses de Tortrix nuisibles graves, pour étudier leur biologie. Jusqu’à présent, la structure des œufs d’insectes a empêché une analyse plus approfondie. Nous avons notamment permis l’étude d’ovules fins, mous et fragiles recouverts de sécrétion maternelle.
Il existe des techniques simples qui devraient être applicables pour d’autres recherches sur la tortrix, en essayant d’autres insectes et d’autres taxons. Commencez par placer une femelle et deux mâles dans un gobelet en plastique de 120 millilitres avec un morceau de papier paraffine pour établir une ligne Matra. Trancher environ 60 grammes de régimes artificiels à l’aide d’une râpe pour l’élevage de masse.
Placez la masse d’œufs remplie d’embryons matures sur le régime artificiel tranché dans un récipient en plastique. Placez des papiers de paraffine sur la masse d’œufs avec les régimes tranchés. Placez 15 mâles et 10 femelles dans une boîte en plastique pour l’accouplement à 25 degrés Celsius.
Recueillez les œufs tous les cinq à sept jours et répétez les étapes d’élevage en masse pour chaque génération. Faire tremper la masse d’œufs dans 1000 microlitres de solution aqueuse d’hypochlorite de sodium à 1,2% pendant 10 minutes ou dans 1000 microlitres de solution aqueuse d’hydroxyde de potassium à cinq molaires pendant 30 minutes pour séparer les œufs. Lavez les œufs séparés dans 1000 microlitres de PBSt.
Faire tremper les œufs dans un mélange poids par volume de 500 microlitres de 100% heptane et de 500 microlitres de solution de 4% de paraformaldéhyde PBSt. Mélanger pendant 10 minutes à 1500 rotations par minute à l’aide d’un mélangeur vortex. Faire tremper les œufs dans un mélange de 500 microlitres de 100% heptane et de 500 microlitres de 100% de méthanol.
Mélanger pendant 10 minutes à 1500 rotations par minute. Lavez les œufs deux fois avec 1000 microlitres de 100% de méthanol et conservez-les à quatre degrés Celsius dans du méthanol à 100%. Faire tremper les œufs séquentiellement dans de l’éthanol à 99 % 70 % et 50 % et du PBSt pendant cinq minutes chacun pour l’hydrophilisation.
Lavez les œufs avec PBSt. Immergez les œufs dans une solution de DAPI d’un microgramme par millilitre pendant cinq minutes, puis lavez les œufs avec du PBS deux fois. Faire tremper les œufs dans 20 microlitres de solution lactique, acétique ou CN à 1,25%, pour visualiser l’hétérochromatine jusqu’à ce que les noyaux présentent une couleur rouge brillant.
Transférez les œufs tachés à l’aide d’une pipette sur une lame en verre, puis entourez-les d’un réactif antidérapant et d’un verre de couverture. Extraire les larves de Ferrate, D’Amonamagnetama et d’Adoxophyes honmai des masses d’œufs à l’aide de pinces. Disséquez les larves sur la lame de verre.
Fixez les tissus avec un mélange d’un à trois acide ascétique à 99,7% dans du méthanol à 100% pendant cinq minutes. Colorez ceux qui ont une solution lactique, ascétique ou CN de 1,25% poids par poids jusqu’à ce que les noyaux soient colorés. Déterminer le sexe de chaque spécimen en observant la présence d’hétérochromatine chez les femelles ou l’absence chez les mâles au microscope.
Pour extraire l’ADN et l’ARN des larves de ferrate déterminées par le sexe, regroupez 12 larves de ferrate mâle ou femelle déterminées par le sexe et ajoutez un tampon de lyse cellulaire ou des réactifs d’extraction d’ARN dans un tube de 1,5 millilitre. Les étapes de fixation, de perméabilisation et de coloration permettent la visualisation des noyaux avec la solution DAPI. La coloration lactique, ascétique ou CN à l’aide des larves de Ferrate disséquées a révélé que les femelles présentent de l’hétérochromatine sous forme de point, mais que les mâles n’ont pas d’hétérochromatine.
Les protocoles modifiés utilisant une colonne de spin ont amélioré la qualité de l’ARN produisant 900 à 1500 nanogrammes de produit avec un rapport de 260 à 200 de 1,9 à 2,1 et un rapport de 260 à 280 de 1,9 à 2,3. Le rapport de concentration d’ARN pour le protocole modifié était inférieur à 1,2, répondant aux exigences de qualité pour le séquençage de nouvelle génération. L’intégrité de l’ARN extrait des larves de ferrate déterminées par le sexe à l’aide du protocole modifié a été confirmée par électrophorèse par micropuce.
Il a été confirmé que les bibliothèques préparées produisaient des lectures de score Q 30 élevées. Notre message contribue aux études fondamentales sur les insectes et aux outils nuisibles. De plus, nos protocoles ont le potentiel d’être utilisés pour évaluer l’efficacité des pesticides chimiques ou des microbes intercellulaires au cours de l’embryogenèse.
