Presentamos masas fundamentales, pero altamente demandadas para la cría en masa, observaciones y estudios moleculares utilizando masas Tortrix de plagas serias, para estudiar su biología. Hasta ahora, la estructura de los huevos de insectos ha impedido un análisis más detallado. Cabe destacar que permitimos el estudio de óvulos delgados, blandos y frágiles cubiertos por la secreción materna.
Se espera que existan técnicas simples aplicables para futuras investigaciones sobre la tortrix, probando otros insectos y otros taxones. Comience colocando una hembra y dos machos en un vaso de plástico de 120 mililitros con un trozo de papel de parafina para establecer una línea Matra. Cortar aproximadamente 60 gramos de dietas artificiales usando un rallador para la cría en masa.
Coloque la masa de huevo llena de embriones maduros en la dieta artificial en rodajas en un recipiente de plástico. Coloque papeles de parafina en la masa de huevo con las dietas en rodajas. Coloque 15 machos y 10 hembras en una caja de plástico para aparearse a 25 grados centígrados.
Recolecte huevos cada cinco a siete días y repita los pasos de cría masiva para cada generación. Remoje la masa de huevo en 1000 microlitros de solución acuosa de hipoclorito de sodio al 1,2% durante 10 minutos o en 1000 microlitros de solución acuosa de hidróxido de potasio molar durante 30 minutos para separar los huevos. Lave los huevos separados en 1000 microlitros de PBSt.
Remoje los huevos en una mezcla de peso por volumen de 500 microlitros de 100% heptano y 500 microlitros de solución de PBSt de paraformaldehído al 4%. Mezclar durante 10 minutos a 1500 rotaciones por minuto usando un mezclador de vórtice. Remoje los huevos en una mezcla de 500 microlitros de 100% heptano y 500 microlitros de 100% de metanol.
Mezclar durante 10 minutos a 1500 rotaciones por minuto. Lave los huevos dos veces con 1000 microlitros de 100% metanol y guárdelos a cuatro grados centígrados en 100% metanol. Remoje los huevos secuencialmente en 99% 70% y 50% de etanol y PBSt durante cinco minutos cada uno para hidrofilización.
Lave los huevos con PBSt. Sumerja los huevos en un microgramo por mililitro de solución DAPI durante cinco minutos y luego lave los huevos con PBS dos veces. Remoje los huevos en 20 microlitros de solución láctica, acética o CN al 1,25%, para visualizar la heterocromatina hasta que los núcleos exhiban un color rojo brillante.
Transfiera los huevos teñidos con una pipeta a un portaobjetos de vidrio, luego encerrarlos con un reactivo antidesvanecimiento y un vidrio de cubierta. Extraiga las larvas de Ferrate, Amonamagnetama y Adoxophyes honmai de las masas de huevos utilizando fórceps. Diseccionar las larvas en el portaobjetos de vidrio.
Fije los tejidos con una mezcla de uno a tres ácido ascético 99.7% en 100% metanol durante cinco minutos. Manche aquellos con 1.25% peso por peso láctica, ascética o solución CN hasta que los núcleos estén teñidos. Determinar el sexo de cada espécimen observando la presencia de heterocromatina para las hembras o ausencia para los machos bajo un microscopio.
Para extraer ADN y ARN de larvas de Ferrato determinadas por sexo, agrupe 12 larvas de ferrato macho o hembra determinadas por sexo, y agregue un tampón de lisis celular o reactivos de extracción de ARN en un tubo de 1,5 mililitros. Los pasos de fijación, permeabilización y tinción permiten la visualización de núcleos con solución DAPI. La tinción láctica, ascética o CN utilizando las larvas de Ferrate diseccionadas reveló que las hembras exhiben heterocromatina como un punto, pero los machos carecen de la heterocromatina.
Los protocolos modificados que utilizan una columna de espín mejoraron la calidad del ARN que produce de 900 a 1500 nanogramos de producto con una relación de 260 a 200 de 1.9 a 2.1, y una relación de 260 a 280 de 1.9 a 2.3. La relación de concentración de ARN para el protocolo modificado fue inferior a 1,2, cumpliendo con los requisitos de calidad para la secuenciación de próxima generación. La integridad del ARN extraído del sexo determinó las larvas de Ferrate utilizando el protocolo modificado mediante electroforesis de microchip.
Se confirmó que las bibliotecas preparadas producían lecturas de alta puntuación Q 30. Nuestro mensaje contribuye a los estudios fundamentales de insectos y herramientas de plagas. Además, nuestros protocolos tienen el potencial de ser utilizados para evaluar los pesticidas químicos efectivos o microbios intercelulares durante la embriogénesis.
