龟科害虫的大规模饲养与分子研究

我们提出了基本但需求量很大的群体，用于大规模饲养，观察和分子研究，使用严重的害虫Tortrix质量，以研究它们的生物学。到目前为止，昆虫卵的结构已经阻止了进一步的分析。值得注意的是，我们研究了母体分泌物覆盖的薄，软和脆弱的卵子。

有一些简单的技术有望适用于对Tortrix的进一步研究，尝试其他昆虫和其他分类群。首先将一名女性和两名男性放入一个120毫升的塑料杯中，并用一块石蜡纸建立Matra线。使用刨丝机切成约60克人造饲料进行大规模饲养。

将充满成熟胚胎的卵块放在塑料容器中切片的人造日粮上。将石蜡纸放在卵块上，切片日粮。将15只雄性和10只雌性放入塑料盒中，在25摄氏度下交配。

每五到七天收集一次卵子，并为每一代重复大规模饲养步骤。将蛋块浸泡在1000微升的1.2%次氯酸钠水溶液中10分钟或浸入1000微升的五摩尔氢氧化钾水溶液中30分钟以分离卵。将分离的卵在1000微升PBSt中洗涤。

将鸡蛋浸泡在500微升100%庚烷和500微升4%多聚甲醛PBSt溶液的体积重量混合物中。使用涡流混合器以每分钟1500转的速度混合10分钟。将鸡蛋浸泡在500微升100%庚烷和500微升100%甲醇的混合物中。

以每分钟 1500 次旋转的方式混合 10 分钟。用1000微升100%甲醇洗涤鸡蛋两次，并将其储存在100%甲醇中，温度为4摄氏度。将鸡蛋依次浸泡在99%70%和50%乙醇和PBSt中5分钟，分别进行水亲。

用PBSt洗涤鸡蛋，将鸡蛋浸入每毫升DAPI溶液中一微克五分钟，然后用PBS洗涤鸡蛋两次。将卵浸泡在20微升的1.25%乳酸，乙酸或CN溶液中，以可视化异染色质，直到细胞核呈现出鲜红色。

使用移液器将染色的卵转移到载玻片上，然后用防褪色试剂和盖玻片将其封闭。使用镊子从卵块中提取铁酸盐，单磁体和Adoxophyes honmai幼虫。在载玻片上解剖幼虫。

用一到三种99.7%苦行子酸的混合物在100%甲醇中固定组织五分钟。用重量为1.25%重量的乳酸，苦行或CN溶液染色，直到细胞核染色。通过在显微镜下观察雌性异染色质的存在或雄性的不存在来确定每个标本的性别。

为了从性别确定的铁酸盐幼虫中提取DNA和RNA，将12个性别确定的雄性或雌性铁酸盐幼虫合并，并将细胞裂解缓冲液或RNA提取试剂加入一个1.5毫升的管中。固定、透化和染色步骤使DAPI溶液的细胞核可视化成为可能。使用解剖的Ferrate幼虫进行乳酸，苦行或CN染色显示雌性表现出异染色质作为点，但雄性缺乏异染色质。

使用自旋柱的修饰方案提高了RNA的质量，产生900至1500纳克的产物，260至200的比例为1.9至2.1，260至280的比例为1.9至2.3。修饰方案的RNA浓度比低于1.2，满足下一代测序的质量要求。使用改良方案从性别测定的Ferrate幼虫中提取的RNA的完整性，使用微芯片电泳确认。

制备的文库被证实产生高Q 30分数读数。我们的信息有助于基本的昆虫研究和害虫工具。此外，我们的方案有可能用于评估胚胎发生过程中有效的化学农药或细胞间微生物。