この方法は、マウスにおけるHBV複製を効果的に抑制するためのiPSC由来ウイルス抗原特異的T細胞の養子細胞移動における主要な質問に答える助けとなる。この技術の主な利点は、iPSC由来のウイルス抗原特異的T細胞が単一型T細胞受容体およびナイーブ表現型を有することである。HBV特異的iPSC CD8陽性T細胞の分化のために、プレートs183 T細胞受容体遺伝子導入iPSCを、20%の胎児ウシ血清およびマウスFlt3リガンドを補ったアルファ最小培地中のOP9-DL1/DL4単層に、細胞培養インキュベーターでの共培養を行った。
細胞形態を評価するために、コカルチャーを定期的に監視します。28日目に上清細胞と浮遊細胞を取り除き、0.25%トリプシンで接着細胞を取り外します。培養容器底から細胞が持ち上がったら、iPSC培地の8ミリリットルで酵素反応を停止し、遠心分離によって細胞を集める。
新鮮な培地の10ミリリットルにペレットを再懸濁します。細胞培養インキュベーターで40時間インキュベートするために、iPSC由来CD8陽性T細胞を4つのs183ペプチドパルス脾細胞比に希釈します。最後の7時間の間に、希釈されたブレフェルディンAの4マイクロリットルを培養物に加え、細胞活性化中の輸送プロセスをブロックする。
標準的なプロトコルに従って目的の細胞内サイトカインのフローサイトメトリック分析のために細胞を染色する。流体力学的HBVプラスミドが尾静脈を通って送達する場合、PBSの体重の8%相当量でHBVプラスミドの10マイクログラムを希釈する。プラスミドを26ゲージ、1/2インチの針を装備した3ミリリットルのシリンジ1本に積み込みます。
ヘルマ灯の下でHHDマウスを5分間加熱して尾静脈を拡張し、マウスを慎重にプラスチックの拘束剤に引き込みます。尾の中央3分の1に拡張された横尾静脈を見つけ、静脈に平行に針を挿入し、3〜5秒の期間にわたって尾静脈を通してプラスミドの全容を送達する。ウイルス抗原特異的iPSC由来CD8陽性T細胞導入細胞の導入については、22日目の培養でiPSC CD8陽性T細胞を採取し、新しい10センチメートル細胞培養皿に播種します。
細胞培養インキュベーターで30分後、70マイクロメートルのナイロンストレーナーを介して浮遊細胞を濾過し、生存細胞を数える。PBS濃度の1ミリリットル当たり7個の細胞に1.5倍10倍に希釈します。ちょうど実証したように、個々の4〜6週齢のHHDマウスに200マイクロリットルの細胞を注入する。
細胞移動後14日目に、実証したように流体力学HBVプラスミド送達を行う。感染後の適切な実験エンドポイントで、感染した各動物から肝臓を収穫し、肝臓を0.5 x 0.5 x 0.3センチメートルの組織サンプルに切断する。サンプルを10%中性バッファーホルマリンに4〜24時間入れ、続いて2.5モルのギ酸で6〜24時間脱灰します。
次に、サンプルをキシレンで3分間リンスし、続いて100%エタノール、95%エタノール、脱イオン水に2分間のリンスを2回加えます。最後の水洗いの後、1ミリモルEDTAの組織を摂氏90度で脱灰し、続いて室温で30分間のインキュベーションを行います。組織が冷却されたら、PBSでサンプルを4分間リンスし、キシレンとエタノールを使用してサンプルを脱パラフィン化し、水分補給します。
免疫蛍光標識の場合、75~100%加湿チャンバで2時間、HBV表面抗原特異的抗体の200マイクロリットルの部分を染色します。インキュベーションの最後に、洗浄ごとに新鮮なPBSで5分間の洗浄でサンプルを洗浄します。蛍光顕微鏡によるイメージング用カバースリップでスライドを取り付ける前に、標準プロトコルに従ってセルにDAPIをラベル付けします。
免疫体系分析のために、標準的なプロトコルに従ってヘマトキシリンおよびエオシンでセクションを染色し、軽い顕微鏡観察によって肝臓への炎症性細胞の浸潤を評価する。iPSC由来CD3陽性CD8陽性集団のフローサイトメトリック解析は、HBV T細胞受容体伝達がウイルスs183特異的CD8陽性T細胞の生成を劇的に増加させることを明らかにした。S183ペプチドでパルスしたT枯渇した脾細胞による刺激後、CD4陰性CD8単一陽性iPSC由来T細胞は、細胞内フローサイトメトリック解析およびELISAによって検出された多数のインターフェロンガンマを産生する。
流体力学的注入によるHBV感染後、DNA複製は6日目にピークを迎え、リアルタイムPCR分析で観察されるように徐々に減少します。さらに、コントロール細胞を受け取るマウスと比較して、HBVウイルス抗原特異的T細胞を受け取るマウスにおいて、ウイルス複製は全ての時点で有意に減少する。HBV表面タンパク質はまた、コントロール細胞で処理されたマウスと比較してHBVウイルス抗原特異的iPSC細胞傷害性リンパ球を受けるマウスにおいても実質的に減少し、ウイルス抗原特異的iPSC CD8陽性T細胞がマウスモデルにおけるHBV複製を減少させる能力を有することを明確に示す。
iPSCからウイルス抗原特異的T細胞を生成して、免疫療法を採用する方法を理解する必要があります。
