我々のプロトコルは、マウス組織におけるオートファジーおよびプロテアソーム活性の速度を測定することを可能にし、これらの活動内の概日変動を検出するのに十分な感度である。この技術は、細胞および組織におけるタンパク質の同化作用を評価するために生体内で使用することができ、必要な材料は比較的低技術であり、任意の分子生物学研究室にアクセス可能である。手順を実証することは、私の研究室のポストドクターであるミハイル・リジコフです。
各タイムポイントの前に15分間、ロイペプチンとボルテゾミブのストック溶液を室温まで温め、解凍したボルテゾミブを無菌PBSで希釈して1ミリリットル当たり50ミリグラムの作業溶液を得る。プロテアーゼ阻害剤投与の場合、腹腔内は1キログラム当たり40ミリグラムのロイペプチンまたはボルテゾミブ1キログラム当たり1.6マイクログラムを各実験動物に注入する。陰性コントロールの場合は、0.5ミリリットルのPBSでマウスを注射します。
各マウスを注入時に受けた治療の種類別にグループ化されたケージに戻し、標準化されたテーブルでマウスが治療または操作された時間を記録します。注射の2時間後、各犠牲実験動物から採取した左肝葉を氷上の15ミリリットル円錐形管に適当に標識した氷冷均質化バッファーの7ミリリットルに沈水する。すべてのサンプルが取得されたら、最初のサンプルとホモジナイゼーションバッファーの全容を15ミリリットル容量のDounceホモジナイザーに移し、緩いピストンの10ストロークとタイトピストンの15ストロークでサンプルを均質化します。
結果として得られた粗ホモゲンを元のチューブに戻し、ちょうど実証したように次のサンプルを均質化します。すべてのサンプルが均質化されたら、遠心分離によってホモジネート核および破片を沈降させ、各核後上清の上位4ミリリットルを新しい15ミリリットルのチューブに移す。標準プロトコルに従ってこの最初の上清分の割合のタンパク質濃度を決定し、必要に応じて新鮮な均質化バッファーで1ミリリットル当たり2.1ミリグラムにすべてのサンプルの濃度を均等にします。
下流の分析と品質改善のために、正規化された全タンパク質分率の500マイクロリットルをマイナス80°Cの貯蔵用に1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管にアリコートした。残りの全タンパク質分画の1.5ミリリットルを個々のマイクロ遠心分離チューブに移し、遠心分離によってタンパク質サンプルをペレットにします。得られた第2分の上清の1ミリリットルを氷上の新しいマイクロ遠心分離管に移し、残りの上清を吸引する。
3Kペレットを1回の新鮮な冷たい均質化バッファーで1.5ミリリットルで2回洗浄し、SDS-PAGEサンプルバッファーの200マイクロリットルで3Kペレットを再中断し、サンプルを摂氏95度で5分間沸騰させます。20、000 x g、摂氏4度で20分間、2分目の上澄み物を回転させ、得られた第3細胞質分画上清を新しいマイクロ遠心チューブに移します。SDS-PAGE分析では、細胞質分画の150マイクロリットルを4x SDS-PAGEサンプルバッファーの50マイクロリットルと組み合わせ、細胞質分率サンプルを摂氏95度で5分間沸騰させます。
20Kペレットから残りの上清を吸引し、1回の洗浄ごとに新鮮な冷ホ均質化バッファーの1.5ミリリットルでサンプルを2回洗浄します。その後、摂氏95度で5分間沸騰させるSDS-PAGEサンプルバッファーの100マイクロリットルに20Kペレットを再懸濁します。ウェスタンブロット分析では、標準曲線タンパク質を1xサンプルバッファーに1~3個ずつ連続希釈して合計6回の希釈液をサンプリングし、各標準曲線サンプルの10マイクロリットルを26ウェル4~12%SDS-PAGEミディゲルの1つのウェルにロードし、先取りした市販の分子量標準をロードします。
オートファガスフラックスを測定するには、各3Kペレットサンプルの12マイクロリットルを適切なウェルにロードする。プロテアソームフラックスを測定するために、各細胞質分画の12マイクロリットルを適切なウェルにロードする。すべての制御サンプルと実験サンプルがロードされたら、標準的なプロトコルに従ってタンパク質をポリビニリデンフッ化物膜に移す前に、SDS-PAGEによってタンパク質サンプルを分離します。
マクロオートファギスフラックスを分析するために、抗p62または抗LcB抗体を摂氏4度で一晩に3Kペレットサンプルを含むブロット膜。プロテアソームフラックスを解析するために、細胞質画分試料を48特異的ポリユビキチン抗体で一晩摂氏4度で含有するブロット膜。次に、標準の二次抗体およびイメージングデバイスを使用して、ウェスタンブロットを画像化します。
標準曲線と実験サンプルの両方に関する目的のバンドに対して密度測定を行うために、適切な画像解析ソフトウェアプログラムを開き、膜の上部に伸びるブロット画像の下部に目的のタンパク質モノマーを包含する長い長方形を描きます。コピーして貼り付けて、残りのサンプルに四角形を移動し、サンプル間で一定の四角形を保持します。スプレッドシートに定量を保存し、線形または多項式回帰で逐次希釈された標準サンプルを使用してスプレッドシート内に密度標準曲線を生成し、最適な標準曲線方程式を得ます。
この式を使用して、実験サンプル内の目的のモノマーの量を推定する。フラックス測定を得るために、各阻害剤処理サンプルの外挿タンパク質量を同じタイムポイントからPBSサンプルの平均値から差し引く。次に、一方向の分散分析を用いて、タンパク質のターンオーバーにおける時間的変動の統計的有意性を評価する。
任意の時点におけるオートファジーフラックスの一次読出しは、リソソーム濃縮された3Kペレット分画で処理されたロイペプチンと偽のサンプルとの間のマクロオートファジー特異的マーカーの量の差を2で割った値である。通常、結果は、独立した実験間の比較を簡素化する平均に正規化されます。タンパク質分解フラックスの測定方法は、時間依存のプロセスであるオートファジーおよびプロテアソーム基質の蓄積を引き起こすロイペプチンまたはボルテゾミブの能力に依存します。
この技術は、生物学的リズムが肝臓タンパク質同化作用をプログラムする方法の探求を可能にしました。この病気が細胞のハウスキーピング機能に及ぼす影響を調査する道が開かれることを期待しています。
