このプロトコルは、C.elegansの生きているおよび老化の目的のタンパク質の分解の追跡および定量化を可能にする。この生体内および非侵襲的な技術は、Dendra2を確実に明るく安定した蛍光色素に変換するために設定された顕微鏡検査をほとんど必要としない。この方法は、哺乳類のシステムだけでなく、ゼブラフィッシュに適応可能です。
研究するには、プロテオスタティスネットワーク内の売上高だけでなく、輸送や人身売買を入れてください。青色光レーザーでスキャン中にDendra2の不要な変換を誘発しないように注意し、各システムと融合タンパク質の取得設定と変換設定をテストし、最適化します。実験の目的の年齢に摂氏20度で年齢に一致する線虫を成長させることから始めます。
イメージング実験の日に、二重蒸留水中の3%濃度で一般グレードのアガロースを溶融した。アガロースが冷却されている間、溶かしたアガロースの約400マイクロリットルの吸引を容易にするために1ミリリットルのピペット先端の先端を切る。慎重にきれいなガラスのスライドにアガロースの数滴を追加し、すぐに2つのガラス片の間にアガロースの薄いパッドを作成するために、ドロップの上に別のスライドを置きます。
アガロースが乾燥したら、上のスライドを慎重に取り外します。十分なスライドが準備されたら、共焦点顕微鏡ソフトウェアを開き、励起および放出のための光路を設定する。緑のDendra2の場合は486〜553ナノメートルを追加し、赤色のDendra2は580〜740ナノメートルを追加します。
両方のチャンネルのパワーとゲインを蛍光素の強度に応じて調整し、ピンホールを完全に開くように設定します。シーケンシャル チャンネル モードを選択し、トラックを設定して、フレームごとに切り替えます。スキャン モードをフレームとして、フレーム サイズを 1024 ~ 1024 に設定し、ライン ステップ 1 を設定します。
平均を 2 に設定し、平均法と単一方向線のモードで平均化します。ビット深度を 8 ビットに設定します。Dendra2 の変換に対する多次元取得設定を定義します。
変換と漂白には、405ナノメートルのダイオードレーザーを60%のエネルギーパワーに設定してください。サイクル間の間隔が 0.0 ミリ秒で、通常の開始と停止の間の 2 サイクルの時系列を選択します。2 つのうち 1 つをスキャンした後に開始するように漂白を設定し、30 回の反復を繰り返し、強度が 50% に下がったときに停止するように設定し、取得ピクセルの速度を高速に変換し、メディアに収まる速度を定義してスナップ 画像をキャプチャします。
線虫をスライドに取り付けるには、パーマネントマーカーを使用して、各スライドのアガロースパッドの反対側に4つの正方形を持つウィンドウを描き、番号を付けます。アガロースパッドの中央にレバミゾールの15マイクロリットルを追加し、ステレオ顕微鏡とワイヤーピックを使用して、年齢に一致した線虫を液滴に移します。まつげピックを使用して、各線虫を広場の1つの窓にそっと動かします。
すべての線虫が再配置されたら、ワームが動かなくなるまで待ってから、液体の上にカバースリップを置き、イメージング中に線虫を固定します。次に、スライドを共焦点顕微鏡のステージに置きます。緑色のDendra2変換の場合、緑色蛍光の下で20 Xの目的の接眼レンズを使用して、最初の線虫を見つけ、頭または尾に焦点を当てます。
共焦点モードに切り替え、ゲインとレーザーパワーを増減して飽和状態にしますが、露出過多の画像は得られません。選択したニューロンの周囲に関心のある領域を描画し、最初の関心領域を含むテールの周囲に、2 番目に大きな関心領域を描画します。取得、漂白、および分析する最初の領域を設定します。
取得して分析する対象の第 2 領域を設定しますが、漂白は行いません。スキャンの速度を最大に設定し、スキャンを開始して選択したDendra2ニューロンを変換します。変換直後に緑色の561ナノメートルレーザーでライブスキャンを開始し、赤チャンネルでDendra2を可視化し、変換されたニューロンの焦点とそれぞれの最大投影を見つけます。
スキャン速度を低いピクセルのデュエル速度にすばやく設定し、両方のチャンネルのスナップショット画像を高い解像度で取得します。この画像は、変換後の時点 0 と見なされます。次に、スキャンを識別可能な名前と番号で保存し、その後にタイム ゼロラベルを付けます。
Dendra2の経時劣化を追跡するには、それぞれの線虫ニューロンの倍ゼロ画像を開きます。同じ画像設定を使用して、赤チャンネルでライブスキャンを開始し、変換された赤いニューロンにフォーカスを移します。次に、取得パラメータを変更することなく、最初の画像と同じ速度でスナップショットを取得します。
Dendra2 を効率的かつ十分に変換し、異なる時間ポイントを通じて同じ取得パラメータを維持するために、変換設定を慎重に定義してください。変換された Dendra2 画像を分析するには、フィジーでタイム ゼロと 2 番目のタイム ポイントイメージを開き、分析と測定の設定を開きます。面積と統合密度関数を選択し、赤チャンネルで取得した画像を選択します。
ポリゴン選択ツールを使用して、時間ゼロ変換されたニューロンの周りに関心のある領域を描画します。ニューロンの輪郭を適切に識別するには、[イメージ]、[調整]、[しきい値]を選択して、強度のしきい値をハイライト表示します。選択を定義したら、[分析と測定] をクリックします。
選択した対象領域の領域、統合密度、および生の統合密度値を含むポップアップ結果ウィンドウが表示されます。2番目のタイムポイントから画像の選択と測定の同じプロセスを実行します。次に、値をスプレッドシートにコピーします。
変換前のこの代表的な分析では、サンプルが赤チャネルで励起されたときに赤信号は見えませんでした。照射時に、HTT-D2が変換され、その後赤信号が現れるにつれて緑色の信号が減少した。HTT-D2発現は経時に分解され、より多くの融合タンパク質が新たに合成されたように、赤色HTT-D2シグナルのレベルの低下と緑色のHTT-D2シグナルの増加の可能性をもたらした。
特に、尾部領域のニューロンは、頭部のニューロンと比較して有意に活性であると判断された。また、変換後24時間、頭部および尾部両方のニューロンにおいて2時間後に制御HTTQ25-D2の著しく多くの分解があった。しかし、この違いは病原性HTTQ97-D2では認められなかったが、プロテオスタシスネットワークは、神経系全体に長いグルタミンストレッチを含むHTT-D2を除去することができなかったことを示唆している。
HTTQ97-D2は、非常に古い線虫のHTTQ25-D2ほど効率的に分解されず、古い動物のハンチンチンの凝集および有毒種を除去するプロテオスタシスネットワークの不備を強調した。重要なことに、尾神経細胞は若い線虫の有毒なHTTQ97-D2に対処することができ、様々な付随するプロテオスタシスネットワークメカニズムがHTT-D2を除去するために働いている可能性があることを示唆した。各サンプルの取得と非露出および非飽和画像変換直後に、そのサンプルに対して同じ設定を一定期間にわたって再利用します。
このプロトコルを使用すると、プロテオスタティスネットワークの変化をテストし、また、超解像顕微鏡の助けを借りて、疾患関連タンパク質の広がいを追跡することが可能です。
