胚救助プロトコルは、異なるククルビタ種間の種間交配に由来する未熟胚の再生に必須です。これは、ククルビタモシャタとククルビタペポの間の交配に最も一般的に使用されます。この手法の主な利点は、その単純さです。
このプロトコルは、抗生物質を含むMS培地のみを使用します。したがって、どのラボでも簡単に複製できます。この手法を変更して、種間または属間ハイブリダイゼーションに対するさまざまな障壁を調査することは可能です。
すべてのステップで詳細に注意を払うことは、成功する結果に役立ちます。窒素、リン、カリウムをそれぞれ1キログラムあたり1.38グラム含む、完全な窒素、リン、カリウム肥料を添加した培養土を使用して、25 x 50センチメートルの50セル開始フラットを埋めることによって、Cucurbita植物を植えることから始めます。次に、種子をその長さに等しい深さまで播種し、培養土で覆います。
溜まった水を作らずにフラットに水をまき、1日1回水をかけて培地を湿らせます。2番目の本葉期の終わりに、鉢ごとに大さじ3杯の完全な肥料を加えた直径30センチメートルの鉢に苗を移植します。7日ごとに、1ガロンの水に加えた1グラムに20、20、20、20の窒素、リン、カリウムを含む500ミリリットルの液体肥料を各ポットに施肥します。
自然光環境下で摂氏22〜28度の温度で温室内の植物を維持します。ブドウの遺伝子型については、温室内に支持トレリスを提供します。植物が播種から6〜8週間で開花し始めたらすぐに、制御されたハイブリダイゼーションまたは受粉を実行します。
花弁に黄色の色合いを持つ未開封の花を確認し、ククルビタペポとククルビタモシャタ品種の雄花と雌花を特定します。偶発的な昆虫の受粉を防ぐために、マスキングテープを使用して閉じた花の上部をそっとテープで留めます。翌朝、午前10:00までに、雄花と雌花のテープで留められた上部をそっと取り外して受粉を行います。
花びらを雄花から分離し、葯を雌花の柱頭にそっとこすって花粉を移します。受粉後、すぐに受粉した雌花をマスキングテープで閉じ、タグを使用して受粉日を記録し、十字架で使用されている父方と母方の両親を示します。拡張した卵巣によって示される成功した交配は、1週間以内に小さな果実を形成します。
受粉の45〜55日後に果物を収穫します。セフォタキシムストックを準備します。滅菌済みの0.22ミクロンシリンジフィルターでろ過します。
また、摂氏マイナス20度で保管する前に、1ミリリットルセフォタキシムあたり250ミリグラムの0.5ミリリットルアリコートを作ります。同様に、アンピシリンストックを準備します。滅菌済みの0.22ミクロンシリンジフィルターでろ過し、摂氏マイナス20度で保管する前に、1ミリリットルのアンピシリンあたり100ミリグラムの1ミリリットルアリコートを準備します。
ムラシゲとスクーグ、またはMS培地を1リットルのボトルに500ミリリットルの蒸留水に2.45グラム溶解して調製します。1.5グラムのジェランガムをMS培地に加え、摂氏121度で20分間オートクレーブします。ボトルを摂氏50度の水浴に入れて培地を冷却します。
層流キャビネット内の抗生物質ストックを解凍します。培地ボトルを層流フードに移し、0.6ミリリットルのセフォタキシムストックと0.25ミリリットルのアンピシリンストックを適切な混合で培地に加えます。約7ミリリットルの培地を60 x 15ミリメートルの滅菌ペトリ皿に注ぎます。
培地をペトリ皿で約15〜20分間固化させます。ペトリ皿をシーリングラップで閉じ、さらに使用するまで室温で保管ボックスに入れます。カボチャの果実をメインのつるから切り取って収穫し、0.3%クロロキシレノールなどの液体洗剤を使用してラボシンクで表面を洗って果物を消毒します。
果物を十分な水道水ですすぎ、清潔なペーパータオルで乾かしてから、果物をラミネートエアフローキャビネットに移します。70%エタノールをスプレーして、キャビネット内の果物の表面を滅菌します。滅菌ナイフで果物を二等分し、種子を抽出します。
滅菌鉗子または滅菌手袋を着用した手を使用して種皮を無菌的に開き、未熟な胚を露出させてから、抗生物質を添加したMS培地を含むペトリ皿に入れます。ラッピングフィルムを使用してペトリプレートを密封し、摂氏25度の温度、16時間の写真周期、および70%の相対湿度の成長チャンバーに置きます。汚染された場合は、汚染されていない胚を直ちに同じ培地を有する新しいプレートに継代培養する。
根が10〜14日後に発達し、子葉が15〜21日後に発達したら、ペトリ皿から小植物を取り除き、水道水を使用して根の周りに存在する培地をそっと洗い流します。きれいにした小植物を14 x 9 x 4センチメートルのプラスチック容器に入れ、根を濡れたペーパータオルで覆います。容器を覆い、必要に応じてペーパータオルを再び湿らせます。
プラスチック容器を摂氏25〜28度に保ち、16時間の写真撮影期間内に、ペーパータオルの湿った状態を維持しながら小植物を順応させます。7〜10日間の順応後、3〜4センチメートルの長さの苗木を、肥料で修正された市販の培養土を含む50セルフラットに移し、温室に移します。腐敗を防ぐために水やりを避け、必要に応じてセルあたり約10〜20ミリリットルの水を追加します。
2〜3番目の本葉段階で、肥料を修正した培養土を満たした直径25センチの鉢に苗を移植し、開花を開始したときに制御された交雑を行います。自然光環境下で温室内の植物を摂氏22〜28度に維持します。そして、果物と種子の特性について植物を評価します。
4つのペポカボチャと11のモシャタカボチャが種間ハイブリダイゼーションのために選択されました。試みられた24の種間交雑の組み合わせのうち、22の交配について果実セットが得られ、果実セットの92%以上の成功を表しています。遺伝子型OとM、および遺伝子型EとJを含むククルビタモシャタとペポカボチャの交配は、成熟した果実を生成しませんでした。
一方、遺伝子型FとJを含むククルビタモシャタとペポカボチャの交配は、6つの果実を生産しました。異なる交配の組み合わせで受粉された花の数は1から11の範囲でした。そして、受粉の成功率は0%から100%の範囲でしたすべての交配の組み合わせから生産された44の果実のうち、ククルビタモシャタとペポの交配からの1つの果物、遺伝子型CとJは、救助できる未熟な胚を生産しました。
これらの発育不良の胚の発生のために、それらは胚レスキュー培地を使用して培養され、その結果、胚レスキューの成功率は80%になりました。最も重要な2つの手順は、2つの種、すなわちモシャタ菌とペポ菌の間の互換性のある交配を特定し、胚再生を成功させることです。胚救助技術は単純で簡単に複製できるため、世界中のスカッシュブリーダーは、異なるククルビタ種間の種間交配に由来する未熟胚を救助するためにこの技術を使用できます。
